用于定义鸟类原始生殖细胞发育的转录组特征

《Protein Expression and Purification》：Transcriptome profiles for defining avian primordial germ cell development

鸡和鹅等鸟类原始生殖细胞（PGCs）的发育机制、体外培养特性及跨物种比较研究，揭示了PGCs在遗传多样性保持、生殖生物技术和进化研究中的关键作用。基因表达谱分析表明，鸟类PGCs发育依赖FGF、BMP和胰岛素信号通路，其表观遗传调控与干细胞特性显著，且存在性别特异性差异。研究还发现鸡PGCs在体外培养中需特定条件（如卵转铁蛋白、钙浓度调控），而鹅PGCs培养需补充胆固醇并依赖BMP4信号。跨物种比较显示，不同鸟类PGCs在增殖相关基因（如FOXL2、CYP19A1）和迁移机制（如整合素表达）上存在保守与特异特征，为鸟类遗传资源保护提供了新思路。

　　在现代生物医学和遗传学研究中，鸟类作为实验模型的重要性日益凸显。鸟类生物学不仅在可持续蛋白质生产、内分泌学、发育生物学、神经科学和免疫学等领域做出了重要贡献，还在生殖生物学和基因资源保护方面展现出独特的价值。其中，原始生殖细胞（Primordial Germ Cells, PGCs）作为胚胎发育过程中形成生殖系的关键细胞，承担着遗传多样性的维持以及生殖细胞发育研究的重任。PGCs的发育和命运决定机制一直是研究的热点，而通过基因表达谱分析所获得的见解，为理解鸟类生殖细胞的形成过程提供了重要线索。本文旨在综述当前关于鸟类PGCs发育和命运决定的研究进展，特别是聚焦于基因表达谱揭示的特征，探讨鸡PGCs在早期胚胎发育中的特性，以及不同鸟类PGCs之间的异同点，以期为鸟类生殖生物学、生殖生物技术和基因资源保护提供新的思路。

### 鸡类PGCs的发育与命运决定

鸡作为研究鸟类生物学的重要模型，其PGCs的发育过程备受关注。PGCs在胚胎发育初期就已出现，它们的定位和迁移对于后续的生殖器官形成至关重要。在受精后，鸡胚胎的早期阶段，PGCs会在胚胎的基底部分出现，这一位置通常与卵裂沟相关。这些PGCs的标志物包括DDX4（也称为CVH）和DAZL，它们在胚胎发育过程中起着关键作用。DDX4和DAZL作为广谱的生殖细胞标志物，其表达水平可以用于追踪PGCs的发育轨迹。研究表明，这些细胞在胚胎发育的早期阶段，即EG & K阶段X，大约有30个DAZL和DDX4阳性的PGCs存在于胚胎的区域pellucida中心，表明它们可能是最初继承了母源决定因子的细胞后代。

随着胚胎的进一步发育，PGCs开始向未来的前部区域迁移，这一过程在Hamburger–Hamilton（HH）阶段4（约18–19小时孵育后）达到高峰，PGCs聚集在胚胎的外胚层区域，形成所谓的“生殖细胞冠”。在HH阶段12（约48–49小时孵育后），PGCs开始通过循环系统向生殖器官迁移，最终在HH阶段15至17（约50–64小时孵育后）进入潜在的生殖器官。进入生殖器官后，PGCs根据性别差异展现出不同的发育路径。在雄性生殖器官中，PGCs的数量仅在HH阶段34至35（约8天孵育后）到HH阶段40（约14天孵育后）之间增加约三倍，而在雌性生殖器官中，PGCs的数量则在相同发育阶段内增加约14倍，显示出性别在PGCs发育过程中的显著影响。

基因表达谱分析揭示了鸡PGCs在发育过程中的一些独特特征。例如，PGCs在代谢过程中表现出更高的能量需求，其基因表达谱中涉及核苷酸代谢相关基因的表达水平显著高于胚胎外的细胞。这表明PGCs在胚胎发育过程中可能需要更多的能量支持，以维持其正常的生理功能。此外，PGCs在基因表达谱中还表现出与胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）不同的特征，尤其是在ABC转运体、TGF-β信号通路和细胞粘附相关通路中的基因表达模式。这些差异提示了PGCs在发育过程中的特殊性，可能与其在生殖器官中的定位和功能有关。

在性别分化方面，基因表达谱分析也提供了重要的信息。例如，在HH阶段25（约4.5天孵育后），雄性PGCs中DMRT1的表达水平显著高于雌性，DMRT1被认为在雄性生殖器官的分化过程中起着关键作用。相反，在雌性PGCs中，FOXL2和CYP19A1（芳香化酶）的表达水平在孵育5–6天后显著上升，这些因子在雌性生殖器官的分化过程中发挥重要作用。此外，RNA-seq分析还表明，在性别分化过程中，PGCs的基因表达谱呈现出明显的性别偏向性，雌性PGCs在4.5至6.5天孵育期间表现出更多的基因表达差异，这提示了雌性PGCs在性别分化过程中可能具有更快的发育速度。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的引入，为深入研究鸡PGCs的发育过程提供了新的视角。通过对不同发育阶段的PGCs进行scRNA-seq分析，研究人员发现PGCs的基因表达谱在性别和发育阶段上存在显著的动态变化。例如，在2.5至6天龄的雄性PGCs和2.5至8天龄的雌性PGCs中，其基因表达谱显示出与后期PGCs相似的特征，这可能意味着这些细胞在发育过程中经历了类似的命运决定过程。然而，随着发育的推进，PGCs的基因表达谱逐渐发生变化，表现出更高的异质性。例如，某些与细胞粘附相关的基因在雄性PGCs中表达水平较低，而这些基因在雌性PGCs中则表现出更高的表达水平。这一发现提示了性别在PGCs命运决定中的重要性，同时也表明不同性别PGCs在发育过程中的行为可能存在差异。

### 体外培养的鸡PGCs特性

尽管鸡PGCs在体内具有独特的发育特征，但它们在体外培养中的表现同样值得关注。鸡PGCs可以在体外条件下被长期培养和扩增，这为研究其自我更新机制提供了重要的实验平台。研究表明，FGF信号通路、Activin信号通路（或BMP4信号通路作为替代）以及胰岛素信号通路的激活对于鸡PGCs的体外自我更新至关重要。此外，女性PGCs通常比男性PGCs增殖速度更慢，因此需要较低的钙浓度以维持其稳定生长，同时避免细胞间粘附的过度增强。

在体外培养条件下，鸡PGCs的基因表达谱与体内PGCs存在一定的相似性，但同时也表现出一些独特的特征。例如，Doddamani等人的研究发现，体外培养的鸡PGCs与体内PGCs的基因表达模式相似，但在细胞增殖相关通路中存在细微的差异。此外，他们还鉴定了某些在雄性和雌性PGCs中表现出性别偏向性的基因，这些基因可能与PGCs的自我更新能力、形态特征以及功能差异有关。

蛋白质组学分析进一步揭示了鸡PGCs在性别方面的差异。例如，卵白蛋白（ovalbumin）等培养基中的添加成分在女性PGCs中表现出更高的富集水平，这表明女性PGCs可能具有更强的蛋白质吸收能力。这一特性可能与其在体外培养中的生存能力有关，也可能是性别分化过程中的一种适应性表现。

最近的研究还表明，体外培养的鸡PGCs表现出转录异质性，某些关键的信号通路，如Hippo、FoxO、AMPK和MAPK通路，可能在PGCs的自我更新过程中起着重要作用。同时，研究者还预测了PGCs在体外培养过程中可能涉及的细胞衰老相关通路，如核糖体和氧化磷酸化（OXPHOS）通路。这些发现不仅加深了我们对鸡PGCs体外培养机制的理解，也为其他鸟类PGCs的体外培养提供了理论依据。

### 鸭类和鹅类PGCs的体外培养特性

虽然鸡PGCs的体外培养已经取得了一定的进展，但其他鸟类PGCs的体外培养研究仍处于初级阶段。近年来，研究者尝试建立其他鸟类PGCs的体外培养系统，如鸭和鹅的PGCs。这些研究的主要目的是为了拓展基因编辑技术的应用范围，并为鸟类基因资源的保存提供新的方法。

鹅PGCs的体外培养研究取得了突破性进展。研究发现，鹅PGCs的稳定体外培养需要激活FGF、BMP和胰岛素信号通路，这与鸡PGCs的培养条件相似。然而，鹅PGCs的培养还涉及到一些特殊的条件，例如较低的钙浓度（0.075 mM）和胆固醇的添加。这些条件可能是为了模拟体内环境，促进PGCs的正常生长和分化。此外，Activin在鸡PGCs的体外培养中被广泛使用，以激活TGF-β信号通路，但在鹅PGCs的培养中却表现出抑制作用，因此需要单独使用BMP4来维持其自我更新。

基因表达谱分析显示，鹅PGCs与鸡PGCs在基因表达上存在一定的相似性，例如DDX4、DAZL、NANOG和PRDM14等基因的表达水平在两种鸟类中均保持较高水平。这表明这些基因可能在鸟类PGCs的发育过程中具有保守性，同时也提示了不同鸟类PGCs之间可能存在一些关键的分子差异。

### 其他鸟类PGCs的研究进展

除了鸡和鹅之外，其他鸟类如斑头雁（zebra finch）和鹌鹑（quail）的PGCs研究也取得了重要进展。斑头雁作为研究鸟类发声学习的重要模型，其PGCs的发育和命运决定机制已被广泛研究。研究发现，斑头雁PGCs的数量在胚胎发育的早期阶段显著高于鸡PGCs，这可能与其独特的生殖发育模式有关。此外，斑头雁PGCs的基因表达谱显示出与细胞增殖和干细胞发育相关的基因显著富集，这提示了斑头雁PGCs在发育过程中可能具有更高的活性。

鹌鹑PGCs的研究则更多地关注其在体外培养中的行为特征。例如，Huss等人的研究发现，鹌鹑PGCs在早期胚胎迁移阶段会表达特定的整合素亚基，并分泌纤维连接蛋白和层粘连蛋白等基质蛋白，这些蛋白有助于构建其外细胞环境。这一发现不仅揭示了鹌鹑PGCs在体外培养中的适应性，也为其他鸟类PGCs的体外培养提供了新的思路。

此外，斑头雁PGCs的scRNA-seq分析还表明，其基因表达谱在不同性别和发育阶段存在显著差异。例如，在HH阶段25，斑头雁PGCs被分为两个不同的群体，其中一个群体高表达与干细胞发育相关的基因，而另一个群体则高表达与生殖细胞命运决定相关的基因。这种分群现象可能反映了斑头雁PGCs在发育过程中的动态变化，同时也提示了不同鸟类PGCs在命运决定机制上的多样性。

### 基因表达谱在鸟类PGCs研究中的意义

基因表达谱分析为研究鸟类PGCs的发育和命运决定提供了重要的工具。通过对不同鸟类PGCs的基因表达谱进行比较，研究人员能够识别出一些保守的基因和信号通路，同时也能够发现不同鸟类PGCs之间的分子差异。这些发现不仅有助于理解鸟类生殖细胞的形成机制，也为生殖生物学、生殖生物技术和基因资源保护提供了新的视角。

例如，鸡PGCs的基因表达谱显示，其在体内和体外环境中均表现出较高的自我更新能力，这可能与其独特的信号通路激活有关。而在斑头雁PGCs的研究中，研究者发现其在体外培养中表现出不同的信号通路活性，这提示了不同鸟类PGCs在自我更新和分化过程中可能存在不同的调控机制。这些差异可能与鸟类的进化历史、生殖发育模式以及生态适应性有关。

此外，基因表达谱分析还揭示了PGCs在性别分化中的关键作用。例如，鸡PGCs中的DMRT1和斑头雁PGCs中的FOXL2L均在性别分化过程中起着重要作用，但它们的表达时间和强度存在差异。这些差异可能反映了不同鸟类在性别分化过程中的不同策略，同时也为研究性别分化机制提供了新的思路。

### 未来研究方向与挑战

尽管基因表达谱分析在鸟类PGCs研究中取得了重要进展，但仍存在一些挑战。例如，目前关于鸟类PGCs的基因表达数据主要集中在鸡和少数实验鸟类模型上，对于其他鸟类PGCs的研究仍较为有限。因此，未来的研究需要进一步扩展基因表达谱的分析范围，以涵盖更多鸟类物种，从而揭示PGCs在不同物种中的共同特征和差异。

此外，体外培养条件的优化仍然是一个重要的研究方向。虽然鸡PGCs的体外培养已经取得了一定的成功，但其他鸟类PGCs的体外培养仍然面临技术难题。例如，鸭和鹅PGCs的体外培养需要特殊的条件，而斑头雁PGCs则表现出不同的信号通路活性。因此，未来的研究需要探索不同鸟类PGCs的体外培养条件，以实现更广泛的生殖细胞研究。

基因表达谱分析还为生殖细胞的功能验证提供了新的方法。例如，通过在体外培养条件下操纵PGCs的基因表达，研究者可以观察其在体内环境中的表现，从而验证某些基因在生殖细胞发育中的功能。这一方法不仅有助于理解生殖细胞的形成机制，也为基因编辑技术的应用提供了新的可能性。

总之，基因表达谱分析为研究鸟类PGCs的发育和命运决定提供了重要的工具。通过对不同鸟类PGCs的基因表达谱进行比较，研究者能够识别出一些保守的基因和信号通路，同时也能够发现不同鸟类PGCs之间的分子差异。这些发现不仅加深了我们对鸟类生殖细胞形成机制的理解，也为生殖生物学、生殖生物技术和基因资源保护提供了新的思路。未来的研究需要进一步拓展基因表达谱的分析范围，优化体外培养条件，并加强对不同鸟类PGCs功能的验证，以实现更全面的鸟类生殖细胞研究。