关于双特异性抗体纯化过程中孔洞和凸起相关杂质的研究

《Protein Expression and Purification》：Study on the hole and knob related impurities in the purification of bispecific antibodies

KiH设计促进异源二聚体形成，但混合不同克隆材料易生成假KiH结构。通过优化阴离子交换色谱（CEX）pH至8.0，利用电荷差异实现杂质高效分离，树脂负载量提升至300 g/L。SEC-UPLC显示纯度达99%，SDS-Caliper NR分析证实功能性KiH占比从85%提升至97%。该成果为异源二聚体纯化工艺提供新策略。

　　

陈焕兰|季乃奇|周茂志|卜盈月

摘要

“凸起插入孔洞”（Knob-into-Hole，简称KiH）设计是一种有效促进重链异二聚化的策略。在本研究中，通过整合先进的分析技术，我们发现了一个关键现象：当混合来自不同克隆的材料（这些材料分别含有孔洞-孔洞同二聚体和凸起-凸起同二聚体）时，初步形成的结构看似符合预期的KiH构型。然而，进一步的SDS-Caliper NR分析表明这些并不是真正的KiH异二聚体。虽然这种现象在表面上看起来是理想的，但它对异二聚体生产的工艺优化产生了显著影响。此外，我们还全面评估了阳离子交换色谱（CEX）在去除同二聚体方面的效果。本研究通过使用来自不同克隆生物反应器的双特异性抗体材料，提出了优化CEX工艺的方法。通过调整CEX的运行pH值，凸起相关杂质和孔洞相关杂质均降至检测限以下（iCIEF分析结果）。同时，SEC-UPLC分析显示纯度提高到99%，SDS-Caliper NR结果显示功能性KiH的比例从输入时的85%提升至洗脱后的97%。这些发现表明CEX工艺有助于提高功能性KiH的比例。

引言

近年来，双特异性抗体在生物技术领域发挥了重要作用，其多样的结构形式使其在诊疗领域具有广泛的应用前景。由于能够同时靶向两种不同的分子，双特异性抗体比传统单克隆抗体具有更高的精确度和疗效。例如，在癌症治疗中，双特异性抗体可以同时作用于肿瘤细胞和免疫效应细胞，从而增强免疫介导的肿瘤细胞杀伤作用[[1], [2], [3]]。

为了构建异二聚体，人们广泛采用了“凸起插入孔洞”（KiH）策略。这一模型最初由Crick在1952年提出，Genentech团队对此技术进行了深入的优化和应用[[4], [5], [6]]。该方法包括对一个重链（HC）进行改造，使其包含一个“凸起”（战略性放置的较大残基），而另一个互补的重链则包含一个“孔洞”（可容纳该凸起的空腔）。凸起与孔洞之间的空间和电静力互补性促进了选择性异二聚体的形成，同时最大限度地减少了同二聚体的生成。重要的是，KiH设计保留了抗原结合能力和Fc功能，从而提高了生产效率和产品纯度——这些都是工业规模生产和临床应用的高标准要求[[5], [6], [7], [8]]。

目前的KiH抗体生产依赖于稳定表达、瞬时表达或体外组装。早期方法是在大肠杆菌（E. coli）中分别表达凸起和孔洞重链片段，随后通过纯化、热变性及重新折叠来形成KiH异二聚体。最近，CHO细胞系统（治疗性抗体生产的黄金标准）也被广泛应用。在瞬时转染过程中，凸起和孔洞重链共同表达，以同二聚体或单体形式分泌，然后在氧化还原条件下（例如谷胱甘肽[GSH]催化）进行体外组装，以促进链间二硫键的形成[[9], [10], [11]]。

尽管KiH技术取得了成功，但在纯化和组装过程中仍会产生同二聚体杂质（如凸起-凸起或孔洞-孔洞对）。这种现象可能是由于结构互补性驱动的异二聚化引起的，其中凸起和孔洞片段通过形状匹配、电荷互补性、氢键作用以及疏水效应相互作用，二硫键进一步稳定了二聚体结构[5,12]。

在本研究中，我们观察到混合含有凸起相关（凸起-凸起）和孔洞相关（孔洞-孔洞）杂质的细胞培养液（HCCF）后，虽然iCIEF、SDS-Caliper NR和SEC-UPLC分析表明形成了看似符合KiH构型的结构，但进一步分析发现这些并不是真正的KiH结构。

这种伪KiH现象可能是由于结构互补性驱动的相互作用（包括形状匹配、电荷互补性、氢键作用和疏水效应）以及二硫键的稳定作用造成的[10]。这种误导可能会严重影响对纯化工艺开发的判断，因为这些伪KiH分子可能逃避标准分析方法的检测，同时无法发挥真正的KiH功能。

目前常用的纯化策略首先是亲和色谱（AC），随后进行两个精处理步骤以去除聚集物和同二聚体杂质。然而，AC存在一些局限性，如洗脱条件苛刻且产率较低。对于阴离子交换色谱（AEX），其结合-洗脱模式的载量能力非常低（15–40 g/L树脂）。一些研究通过使用添加剂等方式优化了混合模式洗脱条件，从而提高了抗体纯度[[13], [14], [15], [16], [17]]。

在本研究中，我们进一步评估了各种杂质去除策略，发现AC效果不佳。相比之下，基于POROS XS的CEX色谱通过利用pH依赖的电荷差异成功分离了凸起相关（凸起-凸起）和孔洞相关（孔洞-孔洞）杂质。这种方法不仅有效去除了杂质，还允许CEX在流动模式（FT）下运行，实现了高达300 g/L树脂的载量能力，从而显著节省了树脂成本。

材料

三水合醋酸钠、乙醇、氯化钠、氢氧化钠和三（羟甲基）氨基甲烷购自德国达姆施塔特的Merck公司。醋酸购自美国新泽西州菲利普斯堡的Avantor公司。MabSelect PrismA树脂购自瑞典乌普萨拉的Cytiva公司。POROS XS购自美国纽约州格兰德岛的Life Technologies公司。Tricorn 5/150柱（内径0.5厘米）也来自Cytiva公司。本研究中使用的目标双特异性抗体在稳定表达系统中产生。

亲和色谱（AC）无法去除未混合样品中的凸起和孔洞相关杂质

初步实验评估了AC去除凸起和孔洞相关杂质的效果。当一个同时含有凸起和孔洞杂质的预混合样品经过一步AC纯化后，iCIEF分析显示杂质显著减少：凸起相关杂质减少了12%（从13%降至1%），孔洞相关杂质减少了5%（从5%降至无法检测的水平）（图1）。然而，当分别纯化含有凸起或孔洞杂质的样品时……

结论

本研究表明，仅仅混合含有孔洞-孔洞同二聚体和凸起-凸起同二聚体的不同克隆材料并不能形成真正的KiH异二聚体（通过SDS-Caliper NR分析验证）。尽管混合后形成的结构在SDS-Caliper NR分析中表现为两种半抗体成分——凸起和孔洞，但实际上这些并不是真正的KiH异二聚体。在开发纯化工艺之前，建议对混合克隆材料进行全面的分析表征，以评估杂质情况。

CRediT作者贡献声明

陈焕兰：撰写初稿、进行正式分析及数据管理。季乃奇：撰写、审稿及编辑。周茂志：撰写、审稿及编辑。卜盈月：撰写、审稿及编辑、方法学设计、概念构思。

致谢

我们感谢周航对这项工作的支持。同时感谢李一峰对手稿的仔细审阅，以及Analytical Sciences Development（AS）的蒋慧贤在分析方面提供的帮助。