《Protein Expression and Purification》：Adaptation of induced pluripotent stem cell technology for avian species
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本研究利用Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28A构建了鸡及濒危鸟类（Okinawa rail、Japanese ptarmigan、Blakiston's fish owl）的iPS细胞，并发现其分化后的神经细胞和肝细胞可用于药物测试和疾病敏感性评估，同时通过嵌合发育鸡蛋生产有用蛋白质，为鸟类保护提供新工具。
片山雅文|福田智和
国立环境研究所生物多样性部门，日本茨城县筑波市小川16-2，邮编305-8506
摘要
自从首次报道从小鼠体内获得诱导多能干细胞（iPS细胞）以来，人们已经成功建立了多种哺乳动物来源的iPS细胞。相比之下，来自鸟类的iPS细胞或类似iPS的细胞则鲜有报道。iPS细胞能够分化为多种类型的细胞（如神经细胞和肝细胞），并且在培养环境中可以无限增殖。与胚胎干细胞不同，iPS细胞是从体细胞生成的，因此无需使用胚胎。由于体细胞可以从已故个体中获取，iPS细胞技术不仅可以应用于鸡，还可以用于其他野生鸟类。我们之前的研究使用改良的Octamer结合转录因子3/4（Oct3/4）、SRY-box转录因子2（Sox2）、Krüppel样因子4（Klf4）、MYC原癌基因（c-Myc）、Nanog和lin-28同源物A（Lin28A）从小鼠体细胞中成功诱导出了iPS细胞。发育中的鸡胚是蛋白质生产的宝贵资源。利用基因编辑或转基因的鸡iPS细胞，我们可以从这些鸡胚中获取有价值的蛋白质。此外，我们还利用改良的Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Klf2从濒危鸟类（如冲绳秧鸡、日本雷鸟和布莱克斯顿鱼鸮）中成功诱导出了iPS细胞。从iPS细胞分化出的细胞（如神经细胞和肝细胞）可用于兽医医学中的药物测试，以及评估对传染病和污染物的敏感性。我们认为，iPS细胞技术可以成为保护濒危鸟类的有力工具。
引言
多能干细胞是鸟类研究的宝贵资源。与体细胞相比，它们具有两大优势：首先，多能干细胞可以在不依赖外源基因表达的情况下分化为多种类型的细胞（如神经细胞和肝细胞）[1,2]；这些分化后的细胞可用于多种研究，包括兽医医学中的药物测试和评估对传染病的敏感性[3, [4], [5], [6]]，因此可以作为体内研究的有效替代方案。其次，多能干细胞在培养环境中可以无限增殖，而体细胞由于细胞衰老的原因无法长期生长[1,2]；因此，一旦成功建立多能干细胞系，就可以持续使用而无需再次取样。
此外，基因编辑或转基因的多能干细胞理论上可以分化为相应的基因编辑或转基因细胞类型（如神经细胞和肝细胞）。这些细胞有助于研究鸟类中的功能基因。与体内研究相比，基于细胞的研究可以降低成本。除了降低成本外，减少体内实验也有助于促进动物福利。因此，基于细胞的研究成为体内研究的替代方案。基因编辑或转基因的多能干细胞在研究鸟类遗传学方面非常有用。
基因编辑或转基因的多能干细胞在引入发育中的鸡胚后，可能有助于形成嵌合体。发育中的鸡胚是蛋白质生产的宝贵资源[7,8]；例如，Oishi等人曾报道转基因鸡可以在其蛋中产生人类干扰素-β[9]。因此，利用基因编辑或转基因的多能细胞，我们可以从鸡胚中获取有价值的蛋白质。总之，鸡的多能干细胞对于蛋白质生产具有重要意义。
多能干细胞通常分为两类：胚胎干细胞（ES细胞）和诱导多能干细胞（iPS细胞）。ES细胞来源于胚胎组织，因此需要使用胚胎[10]；虽然鸡胚易于获取（某些罕见品系除外），但野生鸟类胚胎很少被用于建立ES细胞。与ES细胞不同，iPS细胞是从体细胞中诱导而来的，而体细胞可以从已故个体中获取，这使得iPS细胞技术可以应用于野生鸟类。因此，iPS技术对所有鸟类（包括野生鸟类）都具有巨大潜力（见图1）。
鸟类iPS细胞技术
要理解iPS细胞，首先需要了解小鼠的ES细胞。小鼠ES细胞是从3.5天大的胚胎内细胞团中诱导而来的[10,11]，这些细胞具有分化为多种类型细胞的潜力（包括生殖细胞）。小鼠ES细胞的培养条件最早在1981年被报道[12]，此后这些细胞被用于生成转基因、敲除和敲入小鼠，从而推动了分子遗传学的发展。
鸟类的重编程方法
基于哺乳动物的研究，选择合适的重编程基因对于建立鸟类iPS细胞至关重要。在多种鸟类研究中，已经使用了四种基本的重编程因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc）[23,24,26]；因此，我们也采用了这四种因子作为基础重编程因子。接下来，我们认为添加其他基因可能有助于更有效地建立iPS细胞。
鸟类iPS细胞的特性
鸟类iPS细胞的培养条件与哺乳动物iPS细胞有所不同。我们认为血清是促进鸟类iPS细胞生长的重要因素。在哺乳动物研究中，通常使用血清替代物进行iPS细胞培养（例如敲除血清替代物[35,36]）。与哺乳动物干细胞类似，我们也尝试使用敲除血清替代物来培养鸟类干细胞，但发现这些培养条件不足以使鸟类干细胞自我更新[34]。因此，我们需要进一步探索合适的培养条件。
鸟类iPS细胞的未来
近年来，关于鸟类iPS细胞的几篇综述已经发表[41,42]；此外，也有尝试从鸡中建立iPS细胞的报道[43, [44], [45]]。因此，将iPS细胞技术应用于鸟类被认为是重要的研究领域之一。
发育中的鸡胚是蛋白质生产的宝贵资源[7,8]；基因编辑或转基因的iPS细胞可能有助于嵌合体的形成。
作者贡献声明
片山雅文：负责撰写与编辑工作及初稿撰写。福田智和：负责撰写与编辑工作。
致谢
本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS KAKENHI）和日本科学技术振兴机构（JST FOREST计划）的支持（项目编号：JPMJFR233G）。
