《Protein Expression and Purification》：Enhanced performance of
Thermococcus kodakarensis KOD1 polymerase in PCR via fusion to
Sulfolobus tokodaii Sto7d
编辑推荐：
高温DNA聚合酶KOD通过C端融合Sto7d蛋白提升了延伸效率（成功扩增7kb仅需10秒）、盐耐受性（达120mM NaCl）和最大扩增片段长度（10kb），并较Sso7d融合版本更具耐盐性。
陈乐恒|傅大伟
哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室，中国哈尔滨，150028
摘要
Thermococcus kodakarensis 的 KOD1 (KOD) DNA 聚合酶因其高过程性和保真度而在聚合酶链反应 (PCR) 中得到广泛应用。然而，与其他许多 B 家族 DNA 聚合酶一样，它在延伸效率、扩增子长度以及对抗 PCR 抑制剂的能力方面存在局限性。为了进一步提高其性能，研究人员通过将 Sulfolobus tokodaii 中的一种 7 kDa 非特异性双链 DNA (dsDNA) 结合蛋白 (Sto7d) 通过特定的肽接头连接到 KOD 的 C 端，从而构建了一系列 KOD-Sto7d 聚合酶变体。这些变体经过表达、纯化并进行了特性分析。在所有变体中，KOD-GT4G-Sto7d 表现出最佳的 PCR 性能，被选为后续实验的代表性变体。与野生型 KOD (KOD-WT) 相比，KOD-Sto7d 的延伸效率显著提高，仅需 10 秒即可扩增 7 kb 的目标片段；在 120 mM NaCl 条件下仍能扩增 2 kb 的目标片段；并且能够在 4 分钟内扩增长达 10 kb 的长 DNA 片段。与另一种商业化的 KOD 突变体（其 C 端融合了 Saccharolobus solfataricus 的 dsDNA 结合蛋白 Sso7d，即 KOD-Sso7d）相比，KOD-Sto7d 具有更强的耐盐性和更高的敏感性。这些结果表明，KOD-Sto7d 是一种适用于节省时间和高要求 PCR 应用的稳定聚合酶。
引言
PCR 是一种广泛应用于各个领域以扩增 DNA 片段的关键技术。人们越来越希望 PCR 能够更快、更能抵抗抑制剂，并能够扩增更长的目标片段，尤其是在涉及环境样本的检测中，例如法医分析和医学诊断。PCR 成功的关键因素之一是选择合适的耐热 DNA 聚合酶。KOD 因其高过程性和保真度而受到青睐 [[1], [2], [3]]。然而，像许多 B 家族 DNA 聚合酶一样，KOD 在进行长距离 PCR (超过 5 kb) 时受到其 3′-5′ 外切酶活性的限制 [4]。已有研究表明，将聚合酶结构域与序列非特异性的 dsDNA 结合蛋白融合后，PCR 性能会有显著提升。来自 Saccharolobus solfataricus 的 Sso7d 是一种常用的聚合酶融合伴侣，已被证明可以显著提高聚合酶的过程性 [[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]]。“7 kDa DNA 结合” 蛋白家族在古菌门 Sulfolobales 中较为常见，它们能非特异性地结合 dsDNA。据报道，Sulfolobus tokodaii 的 Sto7d 比 Sso7d 具有更强的耐热性，因此可能是更好的融合候选蛋白 [12]。尽管之前有过融合尝试，但尚未有研究比较不同 KOD-Sto7d 融合体在 PCR 性能上的差异。因此，在本研究中，我们通过特定的肽接头将 Sto7d 基因连接到 KOD 的 C 端，构建了一系列 KOD-Sto7d 融合蛋白。我们的目标是确定最佳的融合方式，并评估这种修饰是否能改善 PCR 性能，特别是在延伸效率、耐盐性和最大扩增子长度方面，从而为提高 PCR 应用性能提供新的方法。
部分内容
常用菌株、载体、试剂和设备
E. coli 菌株 BL21 (DE3) 和 Trans1-T1 从 TransGen Biotech (北京, 中国) 购买。载体 pNET C His 来自 YanDingCheng (哈尔滨, 中国)。载体 pPIC9K 来自 Sangon Biotech (上海, 中国) [13]。KOD 和 Sto7d 的引物及核苷酸序列由 General Biol (安徽, 中国) 合成。KOD 和 Pyrococcus furiosus DNA 聚合酶 (Pfu) 的突变体（其 C 端均融合了 Saccharolobus solfataricus 的 dsDNA 结合蛋白 Sso7d）经过表达和纯化。KOD-GT4G-Sto7d 融合体在 PCR 扩增中表现最佳
所有纯化的 KOD 聚合酶通过 SDS–PAGE 分析纯度均超过 95%（图 2），并且迁移至预期的分子量（KOD-WT 为 90 kDa，融合 KOD 聚合酶为 97 kDa）。为了验证设计的接头对 KOD-Sto7d 融合体 PCR 性能的影响，使用不同的 KOD-Sto7d 融合体和 KOD-WT 扩增了 plasmid pPIC9K 中的 8 kb 目标片段（图 3）。其中，KOD-GTGGGG-Sto7d 融合体在扩增 8 kb DNA 片段方面表现最为出色。
讨论
带有 GTGGGG 连接器的 KOD-Sto7f 融合体在 PCR 扩增中表现出更高的效率、更强的耐盐性和更长的最大延伸长度，优于 KOD-WT。此外，KOD-Sto7d 还显示出比 KOD-Sso7d 更强的耐盐性和敏感性。有趣的是，7 kDa DNA 结合蛋白与 KOD 的融合（KOD-Sto7d 和 KOD-Sso7d）反而导致敏感性降低。我们推测这些 DNA 结合蛋白可能以非特异性方式与模板 DNA 结合。
CRediT 作者贡献声明
陈乐恒：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据可视化，实验设计，概念化。傅大伟：撰写 – 审稿与编辑，验证结果，项目监督，资源协调，方法学设计，资金获取，概念化。
