评估BindCraft在生成高亲和力肽方面的应用

《ACS Chemical Biology》：Evaluating BindCraft for Generative Design of High-Affinity Peptides

研究验证了基于AlphaFold的BindCraft平台在短肽（≤20 residues）设计中的可行性。针对MDM2成功生成70个肽，15个合成后7个显示纳米摩尔级结合，并通过竞争实验确认位点特异性。WDR5的MYC结合位点6/9肽显示亚微摩尔级结合，但WIN位点失败；PD-1/PD-L1肽未获成功。利用结构预测指导理性化学修饰（如stapling）可使WDR5肽亲和力提升6倍至39 nM。结果显示BindCraft可作为低成本替代实验筛选方法，尤其在已知结构数据丰富的靶点中表现突出，但部分复杂界面仍需优化。

　　在药物发现领域，开发高亲和力配体始终是一项关键挑战。传统的药物筛选方法，如基于结构的虚拟筛选，虽然在小分子药物的设计中取得了显著进展，但往往难以达到理想的结合亲和力，多数结果仅在微摩尔范围内，而真正的有效配体比例依然较低。与此同时，蛋白质基结合剂的设计工具也在快速发展，如Rosetta平台能够生成具有高亲和力的迷你蛋白（miniprotein），其在抑制病毒和冠状病毒（如流感病毒和SARS-CoV-2）方面展现出了良好的应用前景。然而，这些方法通常需要复杂的计算流程和实验验证步骤，限制了其在实际药物开发中的广泛应用。

近年来，AlphaFold的出现彻底改变了蛋白质结构预测的领域，并因其在结构生物学中的突破性贡献获得了诺贝尔奖的认可。基于AlphaFold的结构预测能力，BindCraft作为一种新型的结构引导生成模型平台，被开发出来，专门用于从目标蛋白的结构数据中设计具有高亲和力的迷你蛋白结合剂。BindCraft的优势在于其用户友好性，几乎不需要专业的计算知识即可运行，同时其生成的结合剂具有较高的真实命中率（可达10%至100%）。这些特性使其成为药物发现中的有力工具，特别是在快速筛选和优化潜在药物分子方面。

然而，迷你蛋白虽然在研究中具有重要作用，但其在实际药物开发中的应用仍面临诸多挑战。例如，迷你蛋白的结构框架可能引发免疫反应，限制其生物利用度，并且难以进入细胞内部。相比之下，短肽具有更强的化学可合成性、结构灵活性以及更接近药物分子的特性，使其成为更理想的治疗候选分子。短肽不仅能够抑制蛋白质-蛋白质相互作用，还可能具备更好的细胞渗透性和代谢稳定性。近年来，诸如GLP-1类似物、默克公司的PCSK9肽抑制剂以及环状KRAS抑制剂LUNA18等成功案例，进一步证明了短肽在治疗领域的巨大潜力。

尽管短肽在治疗方面展现出广阔前景，但其从头设计（de novo design）仍是一项挑战。短肽通常缺乏稳定的三级结构和内部支架，这使得它们在结合目标蛋白时的亲和力往往不如迷你蛋白。因此，如何在不依赖复杂实验筛选的情况下，利用结构信息高效设计出具有高亲和力的短肽成为研究的热点。BindCraft作为一种结构引导的生成模型，被引入用于这一任务。在本研究中，我们评估了BindCraft在设计短肽结合剂方面的表现，重点关注了三种具有临床意义的靶点：MDM2、WDR5（针对两个不同的结合位点）以及PD-1/PD-L1免疫检查点接口。

对于MDM2这一重要的肿瘤相关蛋白，BindCraft成功生成了70种独特的短肽候选物，其中15种被合成并测试，有7种表现出纳米摩尔级别的特异性结合能力。这些结果表明，BindCraft能够基于目标蛋白的结构信息，直接生成具有高亲和力的短肽。为了进一步验证其结合能力，我们进行了竞争性结合实验，确认了这些短肽能够特异性地结合MDM2的结合位点，从而干扰其与p53的相互作用。这不仅展示了BindCraft在生成短肽结合剂方面的潜力，也表明其在药物开发中的实际应用价值。

在WDR5这一与表观遗传调控和肿瘤发生密切相关的蛋白上，BindCraft同样表现出了良好的性能。WDR5包含两个重要的结合位点：WIN位点（与MLL蛋白结合）和MYC结合位点。我们分别对这两个位点进行了预测，其中针对MYC结合位点的短肽设计成功率达到67%（6/9），其亲和力在纳摩尔至亚微摩尔范围内。值得注意的是，尽管自然存在的MYC肽通常以无序的环状结构与WDR5结合，BindCraft生成的短肽仍然被预测为α-螺旋结构，这种结构有助于提高结合亲和力和稳定性。通过合理的化学修饰，如肽支架（peptide stapling）策略，我们成功将其中一种MYC结合短肽的亲和力提高了6倍，其解离常数（KD）降至39 nM，这表明BindCraft的结构预测能力能够有效指导后续的实验优化，从而提升短肽的结合性能。

尽管BindCraft在MDM2和WDR5的MYC结合位点上表现出色，但在PD-1/PD-L1系统中，其预测的短肽未能显示出可检测的结合能力。这一结果表明，某些靶点的结合界面可能更加复杂，或需要更精细的结构信息来实现有效的结合剂设计。此外，这一发现也提示我们，短肽的设计仍然面临一定的技术障碍，特别是在缺乏稳定二级结构的结合位点上。相比之下，BindCraft在设计迷你蛋白结合剂时已经证明了其强大的性能，但在短肽领域仍需进一步优化。

本研究的核心在于验证BindCraft是否能够将原本用于迷你蛋白设计的算法成功迁移至短肽设计领域。我们通过一系列实验，从结构预测、序列分析、结合测试到化学修饰优化，全面评估了其在短肽生成中的表现。BindCraft的结构预测功能使其能够在无需额外实验验证的情况下，直接提供结合位点的信息，从而指导后续的化学修饰。例如，在WDR5的MYC结合位点上，我们通过引入支架结构，成功提升了短肽的亲和力，这不仅展示了BindCraft的结构预测能力，也体现了其在药物优化中的实用性。

总体来看，BindCraft在短肽设计方面展现出了一定的潜力，尤其是在具有明确结构信息的靶点上。然而，其在某些复杂结合界面中的表现仍需进一步改进。尽管如此，BindCraft的易用性和高命中率使其成为一种极具前景的工具，能够为短肽药物开发提供快速、高效的解决方案。未来，随着生成模型的不断优化，BindCraft可能在短肽设计领域发挥更大的作用，甚至可能在某些情况下超越传统的实验筛选方法，如噬菌体展示或mRNA展示技术，成为结构导向药物发现的首选工具之一。

此外，BindCraft的设计流程和参数配置对于不同类型的靶点具有一定的适应性。在本研究中，我们使用了“peptide_filters_relaxed”这一滤波器集，结合“peptide_3stage_multimer”这一高级设置，以确保生成的短肽序列既符合结构要求，又具备良好的实验可操作性。通过这种方式，BindCraft能够在不进行模型再训练或参数调整的情况下，直接应用于不同的靶点。这种“开箱即用”的特性使其特别适合于那些缺乏计算资源或专业知识的实验室，从而扩大了其在药物发现领域的应用范围。

在实验验证方面，我们采用了生物层干涉（BLI）技术，这是一种常用的结合分析方法，能够准确测量短肽与目标蛋白的结合亲和力。为了确保实验的可重复性和准确性，所有短肽均在相同的实验条件下进行测试，并通过质量控制手段确保其纯度和结构完整性。竞争性结合实验进一步验证了这些短肽是否能够有效干扰目标蛋白的天然相互作用，为它们的治疗潜力提供了初步证据。

BindCraft在短肽设计中的成功应用不仅依赖于其强大的结构预测能力，还与其生成的序列特征密切相关。在MDM2的结合位点上，BindCraft生成的短肽普遍具有α-螺旋结构，并且部分序列包含关键的疏水三联体（F/W/L），这与已知的MDM2结合肽高度相似。而在WDR5的MYC结合位点上，虽然部分短肽的结构与天然MYC肽不同，但它们仍然表现出一定的结合能力，这表明BindCraft能够在结构引导下探索新的结合模式，从而生成具有创新性的短肽结合剂。

尽管BindCraft在短肽设计中取得了一定的进展，但其仍面临一些局限性。例如，在某些结合位点上，即使经过结构优化和化学修饰，短肽的结合亲和力依然较低。此外，短肽的结构稳定性在溶液中可能不如迷你蛋白，这可能导致其在体内环境中表现出较低的生物活性。因此，未来的优化方向可能包括改进生成模型对短肽结构特性的预测能力，以及开发更有效的化学修饰策略，以增强短肽的稳定性和结合能力。

综上所述，BindCraft作为一种基于AlphaFold的生成模型，为短肽结合剂的设计提供了一种新的方法。其在MDM2和WDR5的MYC结合位点上的成功应用，展示了其在药物发现中的潜力。然而，其在某些复杂靶点上的表现仍有待提升。随着技术的不断进步，BindCraft有望成为短肽药物开发的重要工具，为研究人员提供更加高效和精准的结合剂设计方案。