一种无标记纳米孔生物传感器，用于快速且高灵敏度地检测人血清中的放线菌素

《ACS Measurement Science Au》：A Label-Free Nanopore Biosensor for Rapid and Highly Sensitive Detection of Actinomycin in Human Serum

纳米孔技术检测阿霉素（ActD）的原理及其在复杂生物样本中的应用。通过工程α-溶血素纳米孔（M113F?）与GC?探针结合，ActD与DNA形成稳定复合物，显著延长DNA在纳米孔中的驻留时间，产生可区分的电流信号。该方法灵敏度高（检测限1.20 nM），线性范围2.5-250 nM，并成功应用于含人类血清的复杂样本检测，验证了其临床诊断和药物筛选潜力。

　　ActD，一种高效的抗癌药物，源自*Streptomyces antibioticus*，其分子结构包含一个2-氨基苯并噁唑酮染料基团和两个环状五肽内酯。该药物因其独特的DNA结合特性，在多种癌症治疗中被广泛应用，如妊娠滋养细胞疾病、晚期乳腺癌、骨肉瘤和胶质母细胞瘤等。ActD通过插入DNA的GpC位点并占据DNA的沟槽区域，抑制DNA的合成与转录过程，从而阻断细胞的复制和蛋白质合成。由于其对DNA的高特异性结合能力，ActD常被用作研究药物与DNA相互作用的模型分子，有助于开发更高效、更精准的抗癌药物。

在临床、环境和制药领域，对ActD进行痕量检测具有重要意义。然而，现有的检测方法存在诸多限制，如液相色谱-质谱联用技术（LC–MS/MS）虽然具有极高的灵敏度和准确性，但操作复杂、耗时较长，且依赖昂贵的设备。荧光检测方法虽然简便，但灵敏度较低，且无法直接检测ActD本身。而电化学传感器虽然能够实现快速检测，但在复杂生物样本中的应用受限于非特异性药物结合、探针稳定性差以及基质干扰等问题。因此，开发一种更简单、高效、具有高选择性的ActD检测方法成为迫切需求。

近年来，纳米孔传感技术因其快速、灵敏和非标记的特性，逐渐成为药物检测的新选择。纳米孔是一种由蛋白质构成的微小通道，当电压施加于纳米孔时，分子通过其内部的运输会导致电流的变化，从而产生可识别的信号。这种技术已被广泛应用于DNA测序、蛋白质分析、疾病标志物检测以及环境监测等多个领域。其中，α-溶血素（α-HL）纳米孔因其独特的结构和功能特性，被广泛用于研究非共价的DNA-药物相互作用。α-HL是一种由七个亚基组成的蛋白质孔道，其内部结构包括一个约2.6纳米的腔室和一个约1.4纳米的狭窄区域，能够有效区分DNA分子的细微结构差异。

本研究提出了一种基于纳米孔的非标记检测方法，用于ActD的高灵敏度识别。尽管ActD本身在纳米孔中无法产生显著的电流变化，但当它与富含GpC序列的单链DNA探针（GC?）结合时，会形成稳定的DNA-ActD复合物，这些复合物在通过纳米孔时会表现出显著不同的电流信号。通过分析这些复合物的停留时间（dwell time）和事件频率（event frequency），可以实现对ActD浓度的定量分析。实验表明，该方法的检测限（LOD）为1.20 nM，线性检测范围为2.5–250 nM，具有较高的灵敏度和选择性。

为了验证该方法的可行性，研究者还对多种可能的干扰物质进行了评估，包括已知的DNA插入剂（如Dau和EB）和沟槽结合剂（如Netro和DAPI）。这些物质在与GC?结合时会产生不同的事件特征，但只有ActD能够显著改变事件频率和停留时间。通过比较不同浓度下ActD的信号变化，研究人员建立了事件频率与药物浓度之间的线性关系，从而实现了对ActD的准确检测。此外，该方法在复杂的人类血清样本中也表现出良好的选择性和稳定性，说明其在临床诊断中的应用潜力。

为了进一步优化检测条件，研究者对实验参数进行了系统研究，包括电压、盐浓度和金属离子的影响。结果显示，随着电压的增加，GC?-ActD复合物的事件频率显著上升，但过高的电压会导致脂质双分子层的稳定性下降，因此选择+180 mV作为最佳电压。盐浓度的增加则会降低事件频率，这与之前的报道一致，说明盐对DNA-药物相互作用的动态过程具有重要影响。此外，金属离子（如Mg2?和Zn2?）在一定浓度范围内可以提高检测灵敏度，但浓度过高时反而会抑制信号。最终，研究者确定了10 mM Mg2?为最佳的金属离子条件，以确保检测的准确性和稳定性。

在实际应用方面，研究者还测试了该方法在人类血清样本中的表现。由于血清中含有多种蛋白质和脂类成分，直接检测容易受到基质干扰。为此，研究者使用了Cleanascite，一种能够去除脂质和杂质的澄清试剂，以提高检测的可靠性。实验结果表明，该方法在血清样本中仍能有效检测ActD，回收率在95%以上，说明其在复杂生物样本中的适用性。这一成果为纳米孔技术在药物检测领域的应用提供了新的思路，同时也为临床诊断和药物筛选提供了强有力的支持。

本研究不仅展示了纳米孔技术在ActD检测中的巨大潜力，还为开发其他药物的非标记检测方法奠定了基础。通过合理设计DNA探针和优化实验条件，纳米孔传感器能够实现对特定药物的高灵敏度和高选择性识别。此外，该方法无需使用荧光标记或化学修饰，大大简化了实验流程，降低了成本，并提高了检测的实用性。随着纳米孔技术的不断发展，其在药物检测、疾病诊断和环境监测等领域的应用前景将更加广阔。未来，进一步研究不同药物与DNA的相互作用机制，以及如何在复杂样本中提高检测的稳定性，将是推动该技术发展的关键方向。