《Analytical Chemistry》：Hydrogen/Deuterium Exchange for Chiral Stability Assessment in Acidic Methine-Containing Compounds
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The study employs H/D exchange to investigate racemization kinetics of 28 glutarimide-containing compounds (molecular glues, TZDs, and PROTACs) in phosphate buffer at 37°C. Molecular glues exhibit H/D exchange half-lives of 3.0–7.3 h, while TZDs show much faster rates (0.8–1.0 h). PROTACs demonstrate enhanced chiral stability (half-lives >40 h) linked to distinct conformations. Human serum albumin (HSA) accelerates racemization for most compounds but stabilizes others, highlighting complex protein interactions. The method offers high-throughput, enantiomer-free assessment of chiral stability, with kinetic isotope effects (KIE) up to 8.5-fold.构象分析 reveals three primary conformations (linear, bent, folded) but no clear correlation with stability. Results underscore the utility of H/D exchange for early drug development, enabling rapid evaluation of deuterium substitution effects and structural optimization.
在药物研发过程中，分子的立体化学特性对于其药理活性、毒理特性以及整体药效表现具有深远影响。尤其是在涉及含有酸性亚甲基的化合物时，立体异构体之间的相互转化，即“消旋化”或“差向异构化”，可能会导致药物性能的显著变化。这种现象在一些关键药物结构中尤为常见，例如用于治疗癌症和免疫调节的分子粘合剂（molecular glues）以及用于调节血糖的噻唑烷二酮类药物（thiazolidinediones, TZDs）。由于这些化合物在生理条件下容易发生消旋化，因此研究其消旋速率对于确保药物的稳定性和安全性至关重要。
本研究采用了一种创新的氢/氘（H/D）交换方法，以评估28种化合物的消旋或差向异构化动力学，其中包括3种TZDs、13种分子粘合剂以及12种含有戊二酰亚胺骨架的蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）。通过这种方法，研究人员能够在不依赖传统立体选择性色谱技术的情况下，高效地评估化合物的立体化学稳定性。这不仅降低了实验成本，还提高了实验的可操作性，特别是在高通量筛选和药物开发的早期阶段。
在0.1 M磷酸盐缓冲液（D?O，pD 7.8）中，分子粘合剂的消旋半衰期范围为3.0至7.3小时，而TZDs则表现出更快的消旋速率，半衰期在0.8至1.0小时之间。这一差异主要归因于化合物的结构特征以及反应条件对氢键断裂的影响。通过高分辨率质谱（LC-HRMS）和手性超临界流体色谱（SFC）技术，研究人员验证了H/D交换与消旋速率之间的相关性，并进一步发现了主要的同位素效应（pKIE）对消旋速率的显著影响。例如，某些PROTACs的消旋半衰期超过了40小时，这表明它们的立体化学稳定性远高于分子粘合剂。然而，尽管某些PROTACs表现出优异的稳定性，但其与特定构象之间的关系尚未明确，这提示我们仍需进一步研究其构象变化与立体化学稳定性的关联。
此外，本研究还探讨了血浆蛋白（如人血清白蛋白，HSA）对化合物立体化学稳定性的影响。结果表明，HSA与某些化合物的结合可以显著加速或减缓其消旋过程。例如，对于化合物1（thalidomide），其在HSA存在下的H/D交换半衰期从3.9小时大幅缩短至0.3小时，表明HSA能够促进其消旋化。然而，对于某些具有较低游离分数的化合物，如化合物11和14，HSA的结合反而增强了其立体化学稳定性，延长了消旋半衰期。这提示我们，血浆蛋白对化合物立体化学稳定性的影响可能依赖于分子的结合方式、构象以及溶剂可及性等因素。这些发现不仅加深了我们对药物在体内行为的理解，也为优化药物设计提供了重要的参考。
为了进一步分析化合物的消旋动力学，研究人员还计算了活化能，并评估了不同pD值对反应速率的影响。结果表明，分子粘合剂的活化能范围为16.8至24.2 kcal/mol，而TZDs的活化能则较低，介于11.8至13.3 kcal/mol之间。这一差异反映了两种化合物在结构和电子性质上的不同，进而影响其消旋行为。同时，实验还发现，在较低温度（如4°C）下，H/D交换过程几乎停止，这为实验条件的控制提供了新的思路。
在本研究中，研究人员还发现某些化合物（如avadomide）不仅在戊二酰亚胺亚甲基处发生H/D交换，其其他可交换氢原子（如喹唑啉酮甲基）也参与了交换过程。这种多点交换现象使得H/D交换动力学更加复杂，但也为深入理解分子结构与稳定性之间的关系提供了更多维度的信息。此外，研究还指出，虽然H/D交换方法在评估消旋速率方面具有显著优势，但在实际应用中仍需注意其他可能的降解途径。例如，某些化合物在水溶液中容易发生酰胺水解，这种降解机制与消旋化无关，因此在分析过程中需确保方法的准确性。
总的来说，本研究通过H/D交换方法，为评估含有酸性亚甲基的化合物的立体化学稳定性提供了一种快速、高效且通用的解决方案。这一方法不仅能够用于分子粘合剂和TZDs，还适用于PROTACs等新型药物分子。通过结合H/D交换与手性SFC技术，研究人员能够更全面地理解不同化合物在生理条件下的稳定性差异，并为未来药物设计提供科学依据。此外，该方法的高通量特性使其在药物筛选和开发过程中具有广阔的应用前景，有助于提高药物研发的效率和成功率。
