综述：用于非临床免疫原性风险评估的树突状细胞成熟度检测：欧洲免疫原性平台推荐的最佳实践

《Frontiers in Immunology》：Dendritic cell maturation assay for non-clinical immunogenicity risk assessment: best practices recommended by the European Immunogenicity Platform

树突状细胞（DC）成熟试验是药物开发中评估非临床免疫原性风险的关键工具，通过测试样品诱导未成熟单核细胞来源的DC分化为成熟DC的能力，间接反映潜在免疫激活机制。本文系统阐述了试验的核心要素，包括PBMC来源与质量控制、单核细胞纯化方法选择、细胞培养条件优化、标准化对照组设置（背景/功能/灵敏度对照）以及成熟DC的评估指标（如CD80、CD83、HLA-DR等表面标志物及IL-1β、IL-6等细胞因子分泌）。研究强调需通过语境验证（context-of-use validation）解决实验室间操作差异，并对比了DC成熟试验与IIRMI试验、MAPPs试验的适用场景及局限性，特别指出在AAV和mRNA疗法开发中该试验对免疫微环境调控评估的重要性。

　　在生物制药领域，药物开发过程中对非临床免疫原性风险的早期评估与缓解至关重要，它直接影响最终产品的安全性和有效性。作为非临床免疫原性风险评估工具之一，树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）成熟度检测在药物开发流程中被广泛采用。这一检测方法通过观察测试物质是否能够诱导未成熟单核细胞来源的树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells, moDCs）成熟，从而评估可能引发先天免疫反应的因素，并进一步探讨其对适应性免疫反应的潜在影响。这些因素既可以是药物本身的作用机制或结构特性，也可以是最终药物产品中的成分，例如配方中的添加剂、宿主细胞蛋白（Host Cell Proteins, HCPs）或其他杂质。因此，该检测不仅关注药物本身的免疫原性，还涉及其配方、纯度和加工过程中的潜在影响。

树突状细胞是专业的抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cells, APCs），在连接先天免疫系统和适应性免疫系统中发挥关键作用。它们能够识别病原体相关分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs）或损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs），并将其加工成抗原衍生肽，通过人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen, HLA）II类分子呈递给T细胞。这种呈递过程是适应性免疫反应启动的必要条件之一，通常被称为信号1。与此同时，未激活的T细胞还需要信号2，即通过CD28与DCs表面的B7家族分子（如CD80或CD86）的结合来激活。树突状细胞的成熟状态决定了这些共刺激分子的表达水平，而这些分子的表达变化又与免疫反应的强度密切相关。

随着生物制药技术的不断进步，新的治疗模式不断涌现，如多肽、抗体、抗体片段、核酸药物以及细胞和基因疗法等。然而，这些复杂结构的药物在临床应用中面临的一个重要挑战是其可能引发的非预期免疫反应。这种免疫反应不仅会影响药物的安全性，还可能降低其治疗效果。因此，如何在药物开发的早期阶段识别和评估这些免疫原性风险，成为药企和研究机构关注的重点。DC成熟度检测作为非临床免疫原性风险评估的重要工具之一，能够帮助研究人员在药物进入临床试验之前，提前识别可能导致免疫反应的因素。

在药物开发的不同阶段，DC成熟度检测的应用也有所不同。在早期开发阶段，研究者通常关注药物本身是否具有诱导DC成熟的能力，这有助于判断其是否可能引发免疫反应。而在后期开发阶段，检测的重点则可能转向药物配方和关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQAs）对DC成熟的影响。例如，某些药物可能在特定浓度下或特定条件下表现出更强的免疫原性，而这些条件可能与药物的结构、加工过程或配方有关。因此，DC成熟度检测不仅能够帮助研究人员评估药物的免疫原性潜力，还能为后续的药物优化和改进提供科学依据。

为了确保DC成熟度检测的准确性和可比性，研究者需要在实验设计和操作过程中遵循最佳实践。这包括选择高质量的外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）作为起始材料，确保细胞的纯度和活性，并采用合适的细胞纯化方法。同时，实验条件的标准化也至关重要，例如细胞培养基的选择、细胞密度的控制以及测试物质的浓度设定等。此外，实验过程中必须使用适当的对照组，包括背景对照、细胞功能对照和灵敏度对照，以确保实验结果的可靠性。这些对照组不仅能够帮助研究人员评估实验的敏感性和特异性，还能提供基准数据，用于判断测试物质是否引发了显著的免疫反应。

在实验操作方面，研究人员需要关注细胞培养过程中的细节。例如，选择合适的培养基，确保其不会干扰DC的成熟过程；控制细胞密度，以避免过度刺激或不足的刺激；以及合理设定测试物质的浓度，以确保能够检测到潜在的免疫反应。同时，实验的持续时间也需要根据测试物质的性质和研究目的进行优化，以确保能够捕捉到关键的免疫信号。此外，实验过程中还需要定期进行质量控制，包括细胞活性的评估、细胞表型的检测以及细胞功能的验证。这些步骤能够确保实验数据的准确性和一致性，从而为后续的分析和结论提供可靠的依据。

在数据分析方面，DC成熟度检测的结果需要结合实验的设定和质量控制标准进行解读。通常，研究人员会通过计算与背景对照的倍数变化（fold change）来评估测试物质是否引发了显著的免疫反应。此外，使用统计方法如双因素方差分析（Two-way ANOVA）和等效性检验（Equivalence Testing）能够帮助研究人员更全面地分析数据，并判断测试物质是否具有潜在的免疫原性。然而，需要注意的是，即使测试物质在DC成熟度检测中未表现出显著的免疫反应，也不能排除其可能引发其他类型的免疫反应。因此，通常还需要结合其他免疫原性评估工具，如MAPPs（Major Histocompatibility Complex-associated Peptide Proteomics）检测和T细胞增殖实验，以更全面地评估药物的免疫原性风险。

在药物开发的后期阶段，尤其是当药物接近临床试验时，DC成熟度检测的应用更加广泛。此时，研究人员不仅关注药物本身的免疫原性，还可能需要评估其配方和关键质量属性对免疫反应的影响。例如，某些药物可能因为配方中的添加剂或杂质而引发较强的免疫反应，而这些因素可能在早期开发阶段被忽视。因此，在药物开发的不同阶段，DC成熟度检测的侧重点可能有所不同，但其核心目标始终是评估药物是否可能引发免疫反应，并为后续的药物优化提供科学依据。

除了药物本身的因素，DC成熟度检测还能够帮助研究人员理解某些特殊情况下免疫反应的机制。例如，药物中的聚集物（aggregates）可能会影响其免疫原性，而这些聚集物的形成可能与药物的结构、纯度或加工过程有关。在评估这些聚集物的影响时，DC成熟度检测能够提供重要的信息，帮助研究人员判断其是否可能引发免疫反应。然而，需要注意的是，聚集物的浓度通常较低，且其对免疫反应的影响可能较为复杂，因此在检测过程中需要结合灵敏度对照组，以确保能够准确识别潜在的免疫反应信号。

此外，DC成熟度检测还能够用于研究药物与其他免疫相关因素的相互作用。例如，某些药物可能通过与DCs表面的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors, PRRs）结合，从而引发更强的免疫反应。这种反应可能与药物的作用机制无关，而是由其结构或配方中的某些成分所导致。因此，在药物开发过程中，研究人员需要综合考虑这些因素，并通过DC成熟度检测来评估其对免疫系统的潜在影响。

随着生物制药技术的不断发展，新的治疗模式和药物形式不断涌现，例如病毒载体（如腺相关病毒，AAV）和核酸药物（如mRNA疫苗）。这些新型药物在临床应用中也面临免疫原性风险，因此需要在非临床阶段进行系统的评估。对于AAV载体，研究人员通常关注其是否可能引发宿主免疫反应，包括针对病毒衣壳蛋白的抗体反应或由病毒基因组触发的先天免疫激活。对于核酸药物，研究者则更关注其是否可能引发免疫反应，尤其是在其进入人体后，是否可能被宿主细胞识别并引发适应性免疫反应。因此，DC成熟度检测在这些新型药物的开发过程中同样具有重要的应用价值。

为了确保DC成熟度检测的科学性和可重复性，研究人员需要在实验设计和操作过程中遵循最佳实践。这包括选择合适的对照组、优化实验条件、确保细胞质量，并采用统一的数据分析方法。此外，实验结果的解读也需要结合具体的实验背景和目标，以确保能够准确判断药物是否具有免疫原性潜力。例如，在评估药物的免疫原性时，研究人员需要区分其是否是由药物本身引起的，还是由其配方或杂质导致的。因此，DC成熟度检测的结果通常需要与其他免疫原性评估工具结合使用，以提供更全面的免疫反应分析。

总之，DC成熟度检测作为非临床免疫原性风险评估的重要工具，能够帮助研究人员在药物开发的早期阶段识别和评估潜在的免疫反应风险。通过合理选择实验条件、优化操作流程，并结合适当的对照组和数据分析方法，研究人员可以更准确地判断药物是否可能引发免疫反应，并为后续的药物优化和改进提供科学依据。同时，随着新型药物和治疗模式的不断涌现，DC成熟度检测的应用也在不断扩展，为免疫原性风险评估提供了更加全面和系统的解决方案。