利用植物来源的无细胞表达系统，实现烟草花叶病毒样颗粒的高产按需生产

《Frontiers in Nanotechnology》：High-yield on-demand production of tobacco mosaic virus-like particles using a plant-derived cell-free expression system

本研究利用BY-2细胞无细胞裂解系统，成功制备含/无RNA的TMV VLPs，产量达3.56 mg/mL，较微生物系统高23倍，并通过pH稳定性测试验证了其应用潜力。

　　植物病毒样颗粒（VLPs）在纳米材料领域展现出巨大的潜力，因其具备天然的结构特性，可以用于疫苗开发、诊断、组织工程和药物递送等多方面应用。然而，传统的植物病毒纳米颗粒（VNPs）因其携带复制性基因组DNA而可能对环境造成影响，这使得其在某些应用场景中受到限制。相比之下，VLPs缺乏复制性基因组信息，因此不具备感染性，这使其成为更安全的纳米材料选择。尽管如此，VLPs的生产仍面临一些挑战，如产量较低以及难以实现大规模纯化。为了解决这些问题，研究人员利用烟草BY-2细胞的细胞外裂解液（BYL）进行TMV样颗粒的生产，这一方法为VLP的高效、可控合成提供了新的思路。

TMV是一种广泛应用于材料科学和分析领域的模型病毒，其杆状结构的大小为300 × 18纳米，由2130个相同的衣壳蛋白（CP）亚基螺旋排列而成，包裹着一个6.4千碱基对的正链单链RNA基因组。TMV的自我组装过程依赖于一个称为“组装起始区”（OAS）的区域，该区域位于RNA的3′末端附近，并与CP亚基相互作用，促进其自我组装。通过将OAS与CP基因结合，可以引导TMV CP亚基在体外形成具有封装RNA的VLPs。然而，这种基于细胞的生产方式存在一些局限性，如生产周期较长、纯化过程复杂且成本较高。此外，缺乏病毒RNA的VLPs往往在稳定性方面表现不佳，这限制了其在实际应用中的广泛使用。

为了克服上述问题，研究团队采用了一种细胞外表达系统，利用细胞外裂解液在非细胞环境中合成TMV样颗粒。该方法不仅能够显著提高生产效率，还能够减少对植物的依赖，避免潜在的环境风险。细胞外裂解液技术通过在反应开始前将反应模板DNA储存于?80℃，能够在需要时快速启动蛋白合成，从而实现按需生产。此外，这种方法避免了传统植物生产中繁琐的感染和提取步骤，使得整个生产流程更加高效和可控。研究中使用的BYL系统来源于烟草BY-2细胞，该系统已经被商业化，并且能够在10升规模下实现高产量的重组蛋白生产。

实验中，研究人员构建了两种质粒：一种仅包含TMV CP基因，另一种则包含了CP基因和OAS。这两种质粒被用于细胞外裂解液中进行表达，以生成具有和不具有封装RNA的TMV样颗粒。通过SDS-PAGE和Western blot检测，研究人员确认了TMV CP蛋白在细胞外裂解液中的大量积累，且其产量达到了3.56 ± 0.62毫克/毫升。通过ELISA进一步验证，TMV样颗粒的产量在纯化后仍保持较高水平，达到0.70 ± 0.16毫克/毫升，这比微生物表达系统产生的产量高出约23倍。这一结果表明，细胞外表达系统在生产TMV样颗粒方面具有显著优势，能够克服传统植物生产中的低效和高成本问题。

通过透射电子显微镜（TEM）观察，研究团队确认了TMV样颗粒在细胞外裂解液中的形成。TEM图像显示，这些颗粒在pH 7时能够有效组装，并且在pH 8.5的条件下仍能保持稳定。这一发现对于开发适用于不同环境条件的VLPs具有重要意义，因为许多生物医学应用要求材料能够在生理pH范围内保持结构完整性。此外，研究还发现，TMV样颗粒在不同缓冲液中的稳定性存在差异。例如，在pH 5.5的醋酸钠缓冲液中，颗粒倾向于形成较短的结构，而在pH 8.5的Tris缓冲液中，颗粒则表现出更长的形态。这表明，缓冲液的pH值和离子强度对VLP的组装和稳定性具有重要影响。

在纯化方面，研究团队采用CaptoCore700柱层析法对TMV样颗粒进行分离，发现纯化效率分别为15%（TMV_CP）和22%（TMV_CP-OAS）。通过SDS-PAGE、Western blot和TEM检测，研究人员确认了纯化后的TMV样颗粒仍保留了其原始结构特征。此外，半乳糖苷凝胶电泳结果显示，TMV_CP和TMV_CP-OAS颗粒中可能含有封装的RNA。这可能是由于在细胞外裂解液中残留的RNA或体外转录产生的RNA被封装进颗粒中，从而影响了其功能特性。研究人员指出，这种封装RNA的现象可能对VLP的应用产生双重影响：一方面，它可以增强颗粒的稳定性；另一方面，也可能干扰其与生物系统的相互作用或有效释放其负载物。

研究还发现，TMV样颗粒的长度分布存在一定的异质性，这可能是由于在细胞外裂解液中缺乏转录终止子导致的。这种长度的不一致性可能会影响颗粒的表面特性、功能化能力以及在不同应用中的表现。为了解决这一问题，研究团队提出了一些改进策略，如使用线性化的PCR产物作为模板或在质粒中插入终止子序列。这些方法有望提高颗粒的一致性，从而满足工业和医学应用对高纯度、高均一性的需求。

此外，研究团队还对TMV样颗粒的结构进行了进一步分析，使用LC-MS/MS技术检测了其N端的乙酰化情况。结果表明，TMV CP在细胞外裂解液中发生了乙酰化，这可能与其在体外的自我组装能力有关。乙酰化可能增强了CP与RNA的相互作用，从而促进了VLP的形成和稳定性。然而，这一过程的机制仍需进一步研究，以确定乙酰化对VLP功能的具体影响。

从实际应用角度来看，细胞外裂解液技术为TMV样颗粒的生产提供了一种快速、简便且经济高效的途径。相比传统的植物生产方式，该方法不仅缩短了生产周期，还降低了对植物培养条件的依赖，使得生产过程更加可控。同时，该技术还可以用于合成包含非天然氨基酸的蛋白质，从而进一步拓展VLP的应用范围。例如，在疫苗开发中，非天然氨基酸可以用于增强颗粒的免疫原性，或在药物递送中提高其靶向性和载药能力。这些特性使得细胞外裂解液技术在生物医学领域具有广阔的应用前景。

研究还指出，尽管细胞外裂解液技术在生产效率和可控性方面具有显著优势，但在某些情况下仍需进一步优化。例如，颗粒的长度分布和纯化效率可能受到多种因素的影响，包括反应条件、模板DNA的设计以及裂解液的处理方式。因此，未来的优化方向可能包括调整缓冲液的pH值和离子强度，以促进更高效的自我组装过程；改进纯化方法，如采用更精细的柱层析技术或梯度离心法，以提高颗粒的纯度和均一性；以及探索更高效的模板DNA设计，以减少RNA的不稳定性或提高颗粒的负载能力。

总之，细胞外裂解液技术为TMV样颗粒的生产提供了一种创新的解决方案，克服了传统方法中的诸多限制。通过该方法，研究人员能够高效地合成高产量、高稳定性的VLPs，并且能够灵活地调整其结构和功能特性。这一技术不仅有助于推动植物病毒纳米材料在生物医学和工业领域的应用，还为未来的个性化医疗和靶向药物递送提供了新的可能性。随着技术的进一步发展，细胞外裂解液有望成为一种主流的纳米材料生产方式，为可持续发展和精准医疗提供强有力的支持。