使用18S、ITS1和ITS2引物对人类肠道微生物组进行的多标记比较分析

《Frontiers in Bioinformatics》：Multi-marker comparative analysis of 18S, ITS1, and ITS2 primers for human gut mycobiome profiling

肠道真菌组的多标记引物策略分析，采用ITS1、ITS2和18S rRNA单独及组合测序，评估其对真菌多样性分辨率和疾病相关菌群检测的影响。研究显示，ITS1-ITS2组合显著提升OTU数量（183 vs 56），增强癌症患者（CG）与健康对照（CF）中Candida albicans等菌群的差异丰度（LDA=4.7, p=0.026），而18S因非真菌干扰导致分辨率降低。ALDEx2分析证实多标记策略在低样本量下能有效减少引物偏倚，提高菌群结构差异（PCoA分离度达18%）和低丰度菌群（如Penicillium sp.）的检测灵敏度。

　　本研究聚焦于人类肠道真菌群落的分析，旨在探讨不同基因标记区域在肠道真菌多样性研究中的应用效果。随着高通量测序技术的发展，研究人员逐渐认识到肠道微生物群落不仅包括细菌，还包括真菌，它们在维持宿主健康和疾病进展中扮演着关键角色。然而，由于真菌的低生物量、高微生物多样性以及技术限制，检测和分析肠道真菌仍面临诸多挑战。传统培养方法虽然能够提供快速的临床诊断，但其在低丰度真菌物种的分辨率和广泛适用性方面存在局限，而分子方法通过特定基因标记的扩增，显著提升了真菌的检测效率和特异性。然而，引物选择的偏差可能会对结果的准确性和全面性造成影响，因此，研究不同基因标记区域的性能及其组合效果，对于优化肠道真菌分析至关重要。

在本研究中，研究人员选取了八份来自健康个体和癌症患者的粪便样本，采用DNBSEQ?测序系统进行基于扩增子的测序分析。他们分别评估了ITS1、ITS2和18S rRNA三个基因标记区域的性能，包括单独使用和组合使用的情况。通过使用USEARCH进行操作分类单元（OTU）聚类，并结合SILVA和UNITE数据库进行分类，研究人员能够对样本中的真菌群落进行深入分析。此外，他们还利用了多种生物信息学工具，如多样性分析、主成分分析（PCA）和线性判别分析效应大小（LEfSe）来识别生物标志物，从而更全面地理解肠道真菌的组成和动态变化。为了提高分类覆盖率和组成理解，研究人员采用了ALDEx2工具，结合中心化对数比（CLR）变换，以在小样本的宏基因组背景下进行可靠的差异丰度和效应大小评估。

研究结果显示，ITS2和ITS1引物在检测到的分类单元数量上显著优于18S rRNA引物。单独使用ITS1和ITS2引物分别能够检测到158和183个OTU，而18S引物仅能检测到58个OTU。这表明ITS引物在真菌分类分辨率方面具有明显优势。在引物组合方面，ITS1–ITS2–18S的三重组合检测到了最多的OTU（397个），这不仅提升了分类覆盖率，还增强了对低丰度真菌的识别能力。相比之下，ITS1–ITS2的双重组合在组间差异分析中表现更为突出，能够更清晰地识别出与疾病相关的生物标志物，例如在癌症患者中富集的Candida albicans和在健康个体中富集的Saccharomyces cerevisiae。此外，研究还发现，18S引物虽然能够检测到更广泛的真菌种类，但其在物种级别的分辨率较低，且容易引入非真菌的真核生物干扰，从而影响分析的准确性。

在生物信息学分析过程中，研究人员采用了标准化流程，包括物种积累曲线、丰度分析、α多样性、β多样性以及差异丰度的统计评估。通过这些分析方法，他们能够更全面地评估不同引物组合对肠道真菌群落结构和组成的影响力。此外，ALDEx2的使用使得研究人员能够在小样本量的情况下更准确地检测到差异丰度的真菌物种，同时减少由主导物种引起的偏差。相比之下，DESeq2的分析方法虽然在绝对丰度方面表现良好，但在处理真菌群落的组成变化时存在局限性，因为其对主导物种的依赖可能掩盖了其他潜在重要的分类单元。

研究还发现，不同引物组合在识别特定真菌物种和检测疾病相关性方面具有不同的效果。例如，ITS1引物在检测C. parapsilosis和Penicillium sp等低丰度真菌方面表现出更高的灵敏度，而ITS2引物则在捕捉更广泛的真菌种类和提高分类单元数量方面更具优势。此外，研究还指出，某些真菌家族（如Aspergillaceae、Saccharomycetaceae和Pichiaceae）在样本中表现出较高的丰度，这可能与其在肠道生态系统中的生态功能和机会性生长特性有关。而其他低丰度的真菌家族（如Herpotrichiellaceae和Trichomonadaceae）的出现可能受到引物偏差的影响，或者反映其在特定环境中的特异性分布。

研究还探讨了不同引物组合在疾病状态下的表现。例如，在癌症患者和健康个体的对比分析中，ITS1–ITS2的组合能够更有效地识别出与疾病相关的生物标志物，而18S引物虽然能够检测到更广泛的真核生物，但其对真菌的特异性较低，可能导致结果的偏差。此外，研究指出，尽管三重引物组合提供了更全面的分类覆盖，但其带来的数据复杂性也需要更严格的统计分析来确保结果的可靠性。因此，在研究肠道真菌群落时，应结合生物信息学工具和统计方法，以平衡分类分辨率和数据分析的准确性。

从研究方法的创新性来看，本研究首次系统性地比较了多标记策略在肠道真菌分析中的应用效果。通过整合不同基因标记区域的数据，研究人员能够更全面地揭示真菌群落的组成和动态变化，从而为未来的肠道真菌研究提供可靠的起点。此外，研究还强调了在小样本量情况下，采用多标记策略的重要性，因为这有助于提高统计效力和生物标志物的识别能力。尽管研究样本量较小，但其方法论上的可行性为后续研究奠定了基础，尤其是在探索健康和疾病状态下肠道真菌的差异以及其在疾病诊断和治疗中的潜在应用方面。

在实际应用层面，本研究的结果对临床诊断和治疗具有重要启示。例如，Candida albicans在癌症患者中的富集可能表明其与疾病状态之间的潜在关联，而Saccharomyces cerevisiae在健康个体中的富集则可能反映其在维持肠道生态平衡中的积极作用。此外，研究还发现，某些低丰度真菌（如Penicillium sp）可能在疾病进展中发挥关键作用，这为未来研究提供了新的方向。因此，通过优化引物选择和组合策略，研究人员能够更准确地识别与疾病相关的真菌物种，从而推动基于微生物组的精准医学研究。

本研究的局限性在于样本量较小，这可能影响统计效力和结果的普遍适用性。此外，尽管引物选择对分类覆盖和检测灵敏度具有重要影响，但其他因素（如样本质量、宿主状况、真菌负荷和地理差异）也可能对肠道真菌的分析产生影响。因此，未来的研究需要扩大样本规模，并结合更多的变量进行分析，以更全面地理解肠道真菌群落的动态变化及其与疾病状态之间的关系。

总体而言，本研究为肠道真菌群落的分析提供了一种新的方法论框架，强调了多标记策略在提高分类分辨率和识别生物标志物方面的优势。通过结合ITS1、ITS2和18S rRNA引物的数据，研究人员能够更全面地揭示肠道真菌的组成和功能，从而为理解肠道微生物在健康和疾病状态下的作用提供重要依据。此外，研究还突出了在小样本量研究中采用ALDEx2等工具的重要性，以确保数据分析的准确性和可靠性。这些发现不仅有助于推动肠道真菌研究的发展，也为未来的临床应用提供了新的思路。