源自三七的细胞外囊泡通过PI3K/AKT信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

《Frontiers in Pharmacology》：Exosomes derived from Panax notoginseng promote osteogenic differentiation of rBMSCs via the PI3K/AKT signaling pathway

　　

研究人员旨在研究源自三七（Panax notoginseng）的外泌体（exosomes）对大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）成骨分化的影响，并阐明其潜在的细胞内信号机制。方法：采用差速离心（differential centrifugation）结合蔗糖密度梯度离心（sucrose density gradient centrifugation）分离三七外泌体。通过透射电子显微镜（TEM）表征外泌体形态，利用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定粒径分布和浓度。通过流式细胞术（flow cytometry）分离和鉴定rBMSCs，并使用共聚焦显微镜（confocal microscopy）确认荧光标记的三七外泌体被rBMSCs摄取。通过CCK-8法确定外泌体的最佳浓度。通过测量碱性磷酸酶（ALP）活性、进行ALP染色和茜素红S（Alizarin Red S）染色评估成骨分化。在mRNA（RT-qPCR）和蛋白（Western blotting）水平量化成骨标志物（I型胶原（COL1）、ALP、骨桥蛋白（OPN）和Runt相关转录因子2（RUNX2））的表达水平。采用高通量RNA测序（high-throughput RNA sequencing）和生物信息学分析（基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG））鉴定差异表达基因和富集通路。使用特异性抑制剂验证关键通路。结果：源自三七的外泌体通过激活PI3K/AKT信号通路促进rBMSCs的成骨分化。本研究为草药外泌体在骨组织工程和骨质疏松症治疗中的应用提供了实验证据和理论支持。结论：三七外泌体通过激活PI3K/AKT通路促进rBMSCs的成骨分化，为草药外泌体在骨组织工程和骨质疏松症治疗中的应用提供了实验证据和理论支持。

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨量减少、骨微结构破坏和骨脆性增加为特征的全身性代谢性骨病，严重影响中老年人群的身心健康与生活质量。目前临床常用抗OP药物（如双膦酸盐）虽能延缓骨丢失，但长期使用存在胃肠道不良反应、非典型股骨骨折及下颌骨坏死等风险，且患者依从性差。因此，探索更有效、更安全且依从性更好的治疗策略成为OP防治领域的研究重点。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是维持骨组织稳态的关键细胞，但在OP病理微环境中其成骨分化能力显著受损。中药三七（Panax notoginseng）的主要活性成分三七皂苷具有抗炎、抗氧化和促骨修复作用，且已有研究证实其能促进BMSCs成骨分化。近年来，植物来源外泌体（exosomes）因低免疫原性、高生物相容性等优势，在骨疾病治疗中展现出潜力，但三七外泌体是否可通过调控BMSCs成骨分化治疗OP及其机制尚不明确。基于PI3K/AKT信号通路在BMSCs成骨分化中的关键作用，研究人员提出假设：三七外泌体可能通过调节该通路促进成骨。本研究旨在系统评估三七外泌体对rBMSCs成骨分化的影响，并探讨其分子机制，为开发基于植物外泌体的OP治疗新策略提供实验依据和理论支持。该论文发表于《Frontiers in Pharmacology》。

研究人员通过差速离心结合蔗糖密度梯度离心从新鲜三七（产地云南文山）中提取外泌体，利用透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）进行形态与粒径表征。从4周龄SPF级Sprague-Dawley大鼠股骨分离rBMSCs，通过流式细胞术鉴定表面标志物（CD44、CD73、CD105高表达，CD34、CD45低表达）。采用PKH67荧光标记外泌体，通过共聚焦显微镜观察rBMSCs对三七外泌体的摄取。CCK-8法确定最佳外泌体浓度（1×10⁸ particles/mL）。通过ALP活性检测、ALP染色、茜素红S染色、RT-qPCR和Western blotting评估成骨分化。利用高通量RNA测序和生物信息学分析（GO、KEGG）鉴定差异表达基因和富集通路，并以PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002进行验证。

**3.1 三七外泌体的提取与表征及rBMSCs的鉴定**
通过差速离心结合蔗糖密度梯度离心成功提取高纯度三七外泌体，TEM显示典型杯状结构，NTA测定平均粒径约162.5 nm，浓度为7.3×10¹¹ particles/mL。rBMSCs在培养后呈长梭形，流式细胞术显示CD44（99.8%）、CD73（99.8%）、CD105（99.7%）高表达，CD34（1.5%）、CD45（1.7%）低表达，符合rBMSCs表型标准。

**3.2 三七外泌体被rBMSCs摄取及其对细胞活性的影响**
共聚焦显微镜观察显示PKH67标记的三七外泌体（绿色荧光）分布于rBMSCs细胞质中，证实其被有效摄取。CCK-8检测显示，在1×10⁷至1×10⁸ particles/mL浓度范围内，三七外泌体呈剂量依赖性地促进rBMSCs增殖，其中1×10⁸ particles/mL组效果最佳；而1×10⁹ particles/mL组细胞活力显著降低，提示高浓度可能产生细胞毒性。

**3.3 三七外泌体显著增强rBMSCs的成骨分化和矿化能力**
ALP染色和活性检测显示，第7天和第14天，外泌体组（EXO）的ALP活性显著高于空白对照组（NC）和对照组（CON），表明三七外泌体促进早期成骨分化。茜素红S染色及CPC定量分析显示，第14天和第28天，EXO组钙结节形成量显著多于NC和CON组，证实三七外泌体促进晚期矿化。

**3.4 三七外泌体在转录和翻译水平增强成骨标志物表达**
RT-qPCR检测显示，EXO组成骨相关基因COL1、ALP、OPN、RUNX2的mRNA表达水平显著高于CON组。Western blotting结果一致，EXO组COL1、ALP、OPN、RUNX2蛋白表达水平均升高，表明三七外泌体在转录和翻译水平上调成骨相关因子表达。

**3.5 转录组分析揭示三七外泌体可能调控的通路**
主成分分析（PCA）显示CON组和EXO组样本明显分离。差异表达基因分析共鉴定出2298个差异表达基因（DEGs），其中上调1547个，下调751个。GO富集分析显示，DEGs在生物过程（BP）中主要富集于骨代谢、免疫炎症反应、细胞迁移和增殖；在细胞组分（CC）中富集于细胞外基质、膜相关区域和细胞内囊泡；在分子功能（MF）中富集于离子转运、细胞因子活性和脂质结合。KEGG通路分析显示PI3K/AKT通路显著激活。

**3.6 三七外泌体可能通过激活PI3K/AKT通路促进rBMSCs成骨分化**
Western blotting显示，EXO组磷酸化PI3K（p-PI3K）和磷酸化AKT（p-AKT）水平显著高于CON组，而加入PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002后（EXO+LY组），p-PI3K和p-AKT水平显著降低。RT-qPCR和Western blotting进一步显示，LY294002处理显著抑制了EXO组中COL1、ALP、OPN、RUNX2的mRNA和蛋白表达水平，表明三七外泌体通过激活PI3K/AKT通路促进rBMSCs成骨分化。

讨论部分指出，本研究首次证实三七外泌体可通过激活PI3K/AKT信号通路显著促进rBMSCs的成骨分化，为植物外泌体在骨代谢调控中的功能研究提供了新视角，并为开发天然产物为基础的骨靶向治疗策略奠定了理论基础。研究结论原文翻译为：三七外泌体通过激活PI3K/AKT通路促进rBMSCs的成骨分化，为草药外泌体在骨组织工程和骨质疏松症治疗中的应用提供了实验证据和理论支持。