从三七（Panax notoginseng）中提取的外泌体通过PI3K/AKT信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的成骨分化

《Frontiers in Pharmacology》：Exosomes derived from Panax notoginseng promote osteogenic differentiation of rBMSCs via the PI3K/AKT signaling pathway

人参皂苷外泌体通过激活PI3K/AKT通路促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化，并证实其调控骨代谢的分子机制。

　　这项研究围绕着人参皂苷提取物——即从三七（Panax notoginseng）中分离出的外泌体对大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）成骨分化的影响，以及其潜在的细胞内信号通路机制展开。三七作为一种传统中药，长期以来被用于治疗多种疾病，包括心血管疾病、肝肾疾病和骨科疾病，其主要活性成分皂苷类物质已被证实具有显著的生物活性。然而，随着生物医学研究的深入，科学家们逐渐认识到外泌体作为细胞间通讯的重要媒介，在调控细胞功能和疾病进程方面可能发挥关键作用。因此，本研究旨在系统评估三七外泌体对rBMSCs成骨分化的影响，并探讨其潜在的分子机制，特别关注PI3K/AKT信号通路的作用。

### 研究背景与意义

骨质疏松症（OP）是一种常见的系统性代谢性骨病，其特征包括骨质量下降、骨小梁微结构破坏以及骨脆性增加，严重影响中老年人的身心健康和生活质量。全球范围内，OP的患病人数估计高达5亿，其中女性患病率显著高于男性。在中国，2021年的流行病学调查显示，40岁以上人群中男性OP患病率为5.0%，而女性则高达20.6%。尽管现有的OP治疗药物如双膦酸盐类药物在延缓骨流失和降低骨折发生率方面表现出一定疗效，但其长期使用可能导致胃肠道不良反应、患者依从性下降，并与一些严重并发症如不典型股骨骨折和药物相关性骨坏死密切相关。因此，探索具有更高疗效、更好安全性和更强患者依从性的新型治疗策略成为OP研究的重要方向。

在这一背景下，骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为维持骨组织稳态的关键细胞，其成骨分化能力在OP治疗中具有重要价值。正常情况下，BMSCs可以分化为成骨细胞，促进骨形成和代谢平衡。然而，在OP的病理微环境中，BMSCs的增殖、存活和成骨分化能力受到显著抑制，导致骨形成不足，加剧代谢紊乱。因此，有效调控BMSCs的成骨分化能力成为改善OP的关键切入点。近年来，多项研究表明，增强BMSCs相关功能可显著促进骨质量的恢复，这为OP的治疗提供了新的思路。

与此同时，植物来源的药物在OP预防和治疗中的作用也逐渐受到关注。植物药物通常具有多靶点作用和较低的毒性，为纠正骨代谢失衡提供了新的视角。三七作为广泛应用的植物药物，传统上被认为具有活血化瘀、消肿止痛等功效，并被广泛用于创伤相关疾病的治疗。现代药理学研究进一步证实，三七的主要活性代谢产物——人参皂苷，具有显著的抗炎、抗氧化和促进骨修复的作用。其化学结构为三萜皂苷，由三萜类苷元与糖基通过糖苷键连接而成，形成具有两亲性的表面活性分子，有助于其与生物膜的相互作用，从而影响其在骨代谢中的药理作用。已有研究表明，人参皂苷可显著上调成骨相关蛋白表达，恢复骨代谢稳态，抑制骨丢失，并促进骨修复。此外，其代谢产物还被发现能够显著增强BMSCs的成骨分化能力，为三七在OP治疗中的应用提供了坚实的理论基础。

近年来，外泌体作为一种天然分泌的纳米颗粒，在生物医学研究中受到广泛关注。外泌体主要包括细胞外囊泡（EVs），包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。其中，外泌体因其直径在30–150纳米之间，通过多囊泡体与质膜融合后经胞吐作用释放至细胞外，成为细胞间通讯的重要载体。外泌体具有脂质双分子层结构，包裹多种生物活性分子，如蛋白质、脂质、mRNA和非编码RNA等。这些特性使其能够作为细胞间信息传递的桥梁，在多种生理和病理过程中发挥重要作用，如免疫调节、细胞增殖、分化和凋亡等。特别是在骨微环境中，特定来源的外泌体通过协调成骨与破骨细胞之间的平衡、促进血管生成以及调节局部免疫反应，在维持骨稳态和促进骨修复中发挥关键作用。

然而，尽管动物来源的外泌体在调控细胞功能和疾病进展方面展现出巨大潜力，其临床应用仍面临诸多挑战，如复杂的提取过程、低产量和潜在的免疫原性。因此，研究人员开始关注植物来源的外泌体，这些外泌体具有较低的免疫原性、较高的生物相容性以及易于提取的优势，成为治疗骨疾病和开发植物药物的新策略。作为天然的细胞间运输工具，植物外泌体能够通过传递核酸、蛋白质和化学代谢产物，调节靶细胞的生物学行为。尽管已有研究表明，三七来源的外泌体在抗炎和抗肿瘤方面表现出一定的生物活性，但其在OP治疗中的作用及具体机制尚不清楚。鉴于PI3K/AKT信号通路在BMSCs成骨分化中的关键作用，研究者假设三七外泌体可能通过调控这一通路促进成骨分化。基于此，本研究旨在系统评估三七外泌体对rBMSCs成骨分化的影响，并探索其潜在的分子机制，重点聚焦于PI3K/AKT信号通路。

### 研究方法

为了提取和表征三七外泌体，本研究采用了差速离心法结合蔗糖密度梯度离心法。具体而言，三七样品经严格清洗、干燥后，切割成小段并浸入预冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中以防止敏感代谢产物的降解。随后，通过10分钟的匀浆处理，去除粗大颗粒，并通过差速离心（2,000 × g，20分钟；10,000 × g，60分钟）和蔗糖密度梯度离心（68%和27%蔗糖溶液分层）进一步分离外泌体。最终，通过超速离心（100,000 × g，1.5小时）获得粗提外泌体，并通过连续蔗糖梯度（8%、30%、45%和60%）进一步纯化。所有操作均在4°C下进行以减少降解，纯化后的外泌体可立即使用或在-80°C保存以确保其完整性和稳定性。

为了评估三七外泌体的形态和大小分布，本研究采用了透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）。TEM结果显示，三七外泌体呈现出典型的杯状结构，符合外泌体的形态特征。NTA分析显示，三七外泌体的平均粒径约为162.5纳米，浓度约为7.3 × 1011颗粒/毫升。这些数据表明，三七外泌体具有较高的纯度和均匀的大小分布，为后续实验奠定了良好的基础。

为了获取rBMSCs，本研究在符合伦理标准的条件下，对4周龄的SPF级大鼠进行了处理。通过吸入3.5%异氟烷麻醉，确保动物在实验过程中无痛感。随后，通过颈椎脱位法处死大鼠，并在无菌条件下分离股骨。去除周围软组织后，将股骨浸入75%乙醇进行表面消毒，并使用完全培养基反复冲洗骨髓，最终收集细胞悬液。细胞悬液经离心后，将细胞 pellet 重悬于完全培养基中，并在37°C、5% CO?的条件下进行培养。细胞培养过程中，定期更换培养基以去除非贴壁细胞，并在达到80%–90%融合度时进行传代，确保实验使用的细胞处于对数生长期。为了确认rBMSCs的表型特征，使用流式细胞术检测其表面标志物（CD34、CD45、CD44、CD73和CD105），结果显示CD44、CD73和CD105表达率分别为99.8%、99.8%和99.7%，而CD34和CD45的表达率仅为1.5%和1.7%，符合rBMSCs的鉴定标准。

为了确认三七外泌体是否被rBMSCs有效摄取，本研究采用PKH67荧光染料标记外泌体的脂质双分子层，并通过共培养实验观察其在细胞内的分布情况。使用鬼笔环肽（phalloidin）和DAPI分别对细胞骨架和细胞核进行染色，结合激光共聚焦显微镜观察外泌体的摄取情况。结果显示，三七外泌体能够被rBMSCs有效摄取并定位于细胞质中，为后续功能研究提供了必要条件。

为了评估三七外泌体对rBMSCs增殖的影响，本研究采用了CCK-8实验。实验结果显示，在1 × 10?至1 × 10?颗粒/毫升的浓度范围内，三七外泌体对rBMSCs的增殖具有显著促进作用，其中1 × 10?颗粒/毫升为最佳浓度。然而，在1 × 10?颗粒/毫升的高浓度下，细胞活性显著下降，提示高浓度外泌体可能引起细胞毒性或代谢负担。因此，优化三七外泌体的有效浓度对于后续研究至关重要。

为了评估三七外泌体对rBMSCs成骨分化的影响，本研究采用ALP活性测定和染色分析、茜素红S染色以及定量分析等方法。结果显示，三七外泌体能够显著增强rBMSCs的早期和晚期成骨分化能力。ALP活性测定和染色分析表明，在第7天和第14天，EXO组的ALP活性和染色强度均显著高于NC组和CON组，说明三七外泌体能够显著促进早期成骨分化。茜素红S染色进一步显示，EXO组在第14天和第28天均表现出更明显的钙结节形成，表明三七外泌体能够显著促进晚期成骨分化。这些结果表明，三七外泌体在成骨分化过程中具有重要的促进作用。

为了进一步探究三七外泌体对成骨相关基因和蛋白表达的影响，本研究采用RT-qPCR和Western blot技术。结果表明，三七外泌体能够显著上调COL1、ALP、OPN和RUNX2等成骨相关基因的mRNA表达，并在蛋白水平上也表现出显著的上调趋势。这些发现表明，三七外泌体能够通过调控成骨相关基因和蛋白的表达，增强rBMSCs的成骨分化能力。

为了进一步揭示三七外泌体在调控成骨分化中的分子机制，本研究采用高通量转录组测序和生物信息学分析。通过PCA分析，发现EXO组与CON组在基因表达上存在显著差异，且组内一致性较强。DESeq2分析结果显示，共有2,298个差异表达基因（DEGs），其中1,547个基因被上调，751个基因被下调。GO富集分析表明，这些DEGs主要富集于骨代谢、免疫和炎症反应、细胞迁移和增殖等生物过程；在细胞组分（CC）方面，富集于细胞外基质、膜相关区域和细胞内囊泡；在分子功能（MF）方面，富集于离子转运、细胞因子活性和脂质结合等过程。KEGG通路分析进一步显示，PI3K/AKT通路被显著激活，这为后续实验提供了重要线索。为了验证PI3K/AKT通路的参与，本研究采用PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002进行干预实验。结果显示，LY294002的干预显著抑制了三七外泌体对PI3K和AKT蛋白的磷酸化，以及对成骨相关基因和蛋白表达的促进作用，进一步支持了PI3K/AKT通路在三七外泌体调控成骨分化中的关键作用。

### 研究结果

本研究的实验结果表明，三七外泌体能够显著促进rBMSCs的成骨分化，并且其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路密切相关。首先，在形态学和功能学层面，三七外泌体表现出较高的纯度和均匀的大小分布，符合外泌体的特征。其次，rBMSCs能够有效摄取三七外泌体，并将其定位于细胞质中，为后续功能研究提供了基础。在细胞增殖方面，三七外泌体在1 × 10?颗粒/毫升浓度下表现出最佳效果，而高浓度则可能引起细胞毒性，因此需要进一步优化其使用浓度。

在成骨分化方面，三七外泌体显著增强了rBMSCs的早期和晚期成骨分化能力。ALP活性测定和染色分析表明，三七外泌体能够显著提高ALP活性，而ALP活性是成骨分化早期的重要标志物。茜素红S染色进一步显示，三七外泌体能够促进钙结节的形成，表明其对晚期成骨分化具有促进作用。此外，RT-qPCR和Western blot分析显示，三七外泌体能够显著上调COL1、ALP、OPN和RUNX2等成骨相关基因和蛋白的表达，进一步验证了其促进成骨分化的能力。

转录组测序和生物信息学分析揭示了三七外泌体可能调控的多个生物学通路。GO富集分析显示，这些通路主要涉及骨代谢、免疫和炎症反应、细胞迁移和增殖等过程。KEGG通路分析则表明，三七外泌体显著激活了PI3K/AKT通路，而这一通路在成骨分化中具有关键作用。通过LY294002干预实验，进一步验证了PI3K/AKT通路在三七外泌体调控成骨分化中的重要性。实验结果显示，LY294002的干预显著抑制了三七外泌体对PI3K和AKT蛋白的磷酸化，以及对成骨相关基因和蛋白表达的促进作用，从而证明了PI3K/AKT通路在这一过程中的核心地位。

### 研究讨论

本研究的发现表明，三七外泌体在促进rBMSCs成骨分化方面具有重要作用，其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路密切相关。这一结果为植物来源外泌体在骨代谢调控中的应用提供了新的视角，并为基于天然产物的骨靶向治疗策略奠定了理论基础。此外，研究还发现，三七外泌体可能通过调控炎症和氧化应激相关通路，减轻BMSCs的衰老并改善成骨微环境，这为三七外泌体在OP治疗中的潜在应用提供了额外的依据。

然而，本研究也存在一些局限性。首先，目前的研究仅在体外细胞实验中验证了三七外泌体对成骨分化的影响，尚需在动物模型或临床试验中进一步验证其有效性。其次，三七外泌体中具体的生物活性代谢产物及其作用机制仍未完全明确，这可能限制其在临床应用中的针对性和有效性。最后，PI3K/AKT通路与其他代谢通路之间的相互作用仍需深入研究，以全面揭示三七外泌体调控骨代谢的分子机制。

综上所述，本研究系统评估了三七外泌体对rBMSCs成骨分化的影响，并揭示了其可能通过激活PI3K/AKT信号通路促进成骨分化的机制。这些发现不仅为植物来源外泌体在骨代谢调控中的应用提供了理论支持，也为开发基于天然产物的新型骨靶向治疗策略提供了重要参考。未来的研究需要进一步探索三七外泌体的具体生物活性成分及其作用机制，并在更广泛的生物模型中验证其有效性，以推动其在OP治疗中的临床转化。