一名患有难治性自身免疫性溶血性贫血的儿童中发现了一种新的CTLA-4缺失变异体：其分子和功能特征分析

《Frontiers in Immunology》：A novel CTLA-4 deletion variant in a child with refractory autoimmune hemolytic anemia: molecular and functional characterization

儿童难治性自身免疫性溶血性贫血中新型CTLA-4基因缺失变异的功能验证及临床意义。通过三体全外显子测序发现c.362_391del变异，体外实验证实其导致mRNA和蛋白表达显著下降，结构建模显示该变异位于免疫球蛋白V-set结构域，临床管理显示西罗莫司有效但伴高血压性脑病。该研究强调基因检测在难治性AIHA诊断中的重要性。

　　这项研究聚焦于一种新型的CTLA-4基因缺失变异，并探讨其在儿童难治性自身免疫性溶血性贫血（AIHA）中的潜在作用。CTLA-4是一种重要的免疫检查点蛋白，其功能在于调控T细胞的活化，防止免疫系统过度反应，从而维持免疫稳态。当CTLA-4基因发生突变时，可能导致免疫系统的失衡，引发多种自身免疫性疾病。在本研究中，一名6岁女童因反复出现溶血性贫血症状，且对常规治疗反应不佳，最终通过基因检测发现其携带了一种新的CTLA-4基因变异，即c.362_391del，该变异导致CTLA-4蛋白的表达显著下降。这一发现不仅揭示了该基因变异与AIHA之间的潜在联系，也为理解免疫缺陷相关的自身免疫性疾病提供了新的视角。

AIHA是一种由自身抗体介导的溶血性贫血，其临床表现多样，从轻度疲劳到严重的溶血危象不等。诊断AIHA通常依赖于直接抗球蛋白试验（DAT）的阳性结果，以及血液学检查中红细胞破坏的证据。然而，当患者对标准治疗方案如糖皮质激素、利妥昔单抗、静脉注射免疫球蛋白（IVIG）或血浆置换等反应不足时，需考虑其他潜在的病因，包括遗传性免疫缺陷。CTLA-4基因的变异已被广泛报道与免疫失调相关，尤其在儿童中，某些CTLA-4基因突变可能与难治性自身免疫性血小板减少症（ITP）或AIHA等疾病有关。

本研究中，通过三联体全外泌基因组测序（Trio-based whole-exome sequencing, WES）对一名6岁女童及其父母的基因组进行了分析，成功鉴定了该患者携带的CTLA-4基因变异。进一步的Sanger测序验证了该变异的遗传来源，并确认其为母系遗传。值得注意的是，该变异在既往文献中未被报道，且在大规模人群数据库gnomAD中也未发现记录，因此被归类为意义未明的变异（VUS）。尽管如此，该变异对CTLA-4蛋白表达的影响通过体外实验得到了验证，结果显示其显著降低了mRNA和蛋白的表达水平，提示该变异可能在免疫系统调控中发挥了关键作用。

从临床表现来看，该患者在发病前曾被诊断为ITP，但血小板计数始终正常，这与CTLA-4缺陷的典型表现不同。然而，她随后出现了严重的AIHA症状，包括严重贫血、黄疸和血红蛋白尿，且对糖皮质激素和利妥昔单抗的治疗反应不佳。在开始使用西罗莫司（sirolimus）治疗后，患者的溶血症状得到了一定程度的缓解，但随后出现了神经系统症状，如意识障碍、癫痫发作和昏迷。这表明，尽管CTLA-4缺陷可能与AIHA相关，但其对其他器官系统也可能产生影响，尤其是神经系统。影像学检查显示，患者的脑部在神经系统症状出现时出现了FLAIR和DWI序列上的高信号区域，这些区域主要位于枕叶和顶叶，提示可能存在脑部炎症或损伤。然而，患者同时伴有高血压，这可能是导致神经系统症状的直接原因。经过及时的降压治疗，患者的神经系统症状和影像学异常均得到了显著改善，进一步支持了高血压脑病（hypertensive encephalopathy）作为主要病因的判断。

为了深入理解该变异对CTLA-4蛋白结构和功能的影响，研究团队进行了蛋白质结构建模分析。结果显示，该变异导致CTLA-4蛋白中从第121位到第130位的氨基酸序列缺失，这一区域位于免疫球蛋白V结构域内，是CTLA-4与CD80/CD86等共刺激分子结合的关键部位。因此，该变异可能干扰CTLA-4的正常功能，进而影响免疫系统的调节能力，导致自身免疫反应的失控。此外，体外功能实验进一步证实了这一假设，qPCR和Western blot的结果均显示，该变异显著降低了CTLA-4的mRNA和蛋白表达水平，表明其在分子层面可能对免疫系统产生了实质性的影响。

从免疫表型分析来看，该患者在治疗前表现出显著的淋巴细胞亚群失调，包括B细胞数量增加、CD8+ T细胞比例升高、CD4+/CD8+比值倒置以及NK细胞数量显著减少。这些异常与CTLA-4缺陷的典型免疫表型高度一致。治疗后，特别是使用西罗莫司后，这些免疫异常得到了明显改善，CD4+/CD8+比值恢复正常，NK细胞比例接近正常范围，CD4+ T细胞数量和比例也有所回升。这不仅支持了CTLA-4缺陷作为该患者疾病的潜在病因，也说明西罗莫司在调控免疫反应方面的有效性。

CTLA-4缺陷是一种由单基因突变引起的免疫系统失调疾病，其临床表现具有高度的异质性。尽管该疾病在成人中较为常见，但越来越多的病例显示，儿童也可能受到影响。然而，由于CTLA-4缺陷的临床表现多样，且存在不完全外显率，使得其诊断难度增加。例如，一些携带CTLA-4变异的个体可能终身无症状，而另一些则可能在儿童期或青少年期出现明显的免疫异常。在本研究中，尽管该患者的母亲和亲属未表现出明显症状，但该变异仍可能通过某种机制增加了其患自身免疫性疾病的易感性。

CTLA-4缺陷的临床表现不仅限于血液系统疾病，还可能涉及多个器官系统，包括神经系统、内分泌系统和皮肤等。本案例中，患者除了AIHA外，还出现了严重的神经系统症状，这在CTLA-4缺陷的文献中已有报道。例如，一些患者在CTLA-4缺陷的情况下，出现了弥漫性白质病变、基底节异常、小脑萎缩等影像学特征。尽管本案例的神经异常可能主要由高血压引起，但CTLA-4变异可能在一定程度上加重了免疫系统的紊乱，从而间接影响了神经系统。因此，对于携带CTLA-4变异的患者，应保持高度的警惕，特别是在出现神经系统症状时，需综合考虑免疫相关和非免疫相关因素。

此外，本研究还指出了当前诊断和治疗中的局限性。首先，由于该变异为VUS，缺乏明确的致病性证据，因此在临床实践中仍需谨慎对待。其次，尽管体外实验提供了该变异对CTLA-4表达的负面影响，但其具体致病机制仍需进一步研究。例如，该变异是否通过影响mRNA的稳定性或翻译效率导致表达水平下降，或者是否通过其他机制干扰了CTLA-4的功能，这些都需要更深入的实验验证。同时，由于患者来源的原始细胞难以获取，限制了对CTLA-4在Treg细胞上的表达和功能分析，这为未来的研究提出了挑战。

综上所述，本研究通过基因检测和体外实验，发现了一种新的CTLA-4基因变异，并探讨了其在儿童难治性AIHA中的潜在作用。该变异不仅影响了CTLA-4的表达水平，还可能通过干扰其结构和功能，导致免疫系统的失衡。临床表现为AIHA和神经系统症状的组合，提示CTLA-4缺陷可能具有更广泛的病理影响。尽管本案例为单个患者的研究，但其结果为理解CTLA-4缺陷的临床表现和治疗策略提供了新的线索。未来的研究应进一步扩大样本量，以验证该变异的普遍性和致病性，并探索其在免疫调节中的具体机制。同时，应加强针对携带CTLA-4变异患者的临床监测，特别是在使用免疫抑制剂治疗时，需注意其可能引发的副作用，如高血压和神经系统并发症。这些发现不仅有助于提高对儿童难治性AIHA的诊断水平，也为个体化治疗策略的制定提供了依据。