利用新型耐冷副干酪乳酸杆菌提升高寒地区全株玉米青贮发酵品质及调控菌群机制研究

《BMC Plant Biology》：Enhancing low-temperature fermentation quality and modulating bacterial community of whole-plant maize silage using a novel cold-tolerant Lacticaseibacillus paracasei

本研究针对青藏高原低温环境下全株玉米青贮发酵效率低、乳酸菌活性不足的产业难题，通过接种自主筛选的耐冷副干酪乳酸杆菌Lacticaseibacillus paracasei YZ3，系统评估了其在15°C和25°C下对青贮发酵特性、化学成分及细菌群落的影响。结果表明，YZ3菌株在低温条件下能显著提高乳酸含量、降低pH值和丙酸含量，并通过促进植物乳杆菌增殖、维持菌群稳定性及增强氨基酸和碳水化合物代谢，有效优化了低温青贮品质，为高寒地区饲草保鲜技术提供了重要科学依据。

　　

在全球粮食安全、经济发展和能源危机缓解中扮演关键角色的玉米（Zea mays L.），其全株利用有助于减少资源浪费和环境污染。然而，在平均年气温低于15°C的青藏高原地区，工业规模的全株玉米青贮生产面临着巨大挑战：附生乳酸菌（LAB）活性低、发酵效率差，常常导致发酵不完全或质量不佳。自然发酵过程容易被有害细菌或潜在病原体（如哈夫尼菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属）主导，造成乳酸发酵不足、丁酸产量增加以及蛋白质过度降解，引发严重的营养损失和经济损失。

乳酸菌接种剂作为有效的发酵启动培养物，其效果取决于菌株特性和环境依赖性。研究表明，大多数与厌氧发酵相关的乳酸菌最适生长温度在20至30°C之间。低温会通过破坏糖酵解和脂质代谢等关键途径，损害乳酸菌的生长和代谢，延长发酵时间，增加营养损失，并促进腐败微生物增殖，最终损害发酵质量甚至导致发酵失败。迄今为止，研究主要集中在最适温度（>20°C）下的发酵，而在像青藏高原这样持续寒冷的环境中，乳酸菌在全株玉米青贮中的表现很大程度上仍是未知的。青藏高原的极端环境（如低温和缺氧）驱动本土微生物进化出独特的结构和生理机制，增强了其胁迫耐受性。据报道，微生物胁迫基因多样性随着海拔升高而增加。这些经过长期自然驯化的本土微生物对极端条件表现出优异的适应性，使得该地区成为发现新型高性能微生物菌株（尤其是具有耐寒等优良性状的菌株）的宝贵天然资源库。

先前的研究从青藏高原的全株玉米青贮中分离出了一株新型耐冷菌株——副干酪乳酸杆菌Lacticaseibacillus paracasei YZ3（CGMCC No. 23156）。该菌株在4-40°C的宽温度范围内表现出强劲的生长能力，并能耐受pH 3.0以及6.5%的NaCl。然而，其在低温全株玉米青贮中的实际效果和潜在机制尚不清楚。

为了确保青藏高原全株玉米的有效保存并提升其营养价值和利用效率，本研究评估了自主筛选的耐冷乳酸菌菌株L. paracasei YZ3对全株玉米青贮在低温（15°C）条件下的发酵品质、化学组成和细菌群落动态的影响。研究结果有望为改善青藏高原乃至全球其他寒冷地区高效大规模工业生产系统中主要饲草作物（如玉米）的保存质量和利用效率提供关键科学证据，从而促进这些挑战性环境中畜牧业的可持续发展。

本研究采用完全随机设计，进行3（处理：LPC、YZ3、对照）×2（发酵温度：15°C、25°C）×3（发酵天数：30、60、90天）的因子安排。将收获的全株玉米切碎后，分别接种商业植物乳杆菌LPC、自主分离的耐冷菌株YZ3或不接种（对照），真空密封于聚乙烯袋中，在指定温度下厌氧发酵。主要技术方法包括：使用高效液相色谱法测定有机酸（乳酸LA、乙酸AA、丙酸PA、丁酸BA）含量和pH值；采用标准方法分析干物质DM、粗蛋白CP、中性洗涤纤维NDF、酸性洗涤纤维ADF和水溶性碳水化合物WSC等化学成分；通过平板计数法监测微生物种群；并利用基于Ion S5x XL平台的高通量测序技术对细菌群落DNA进行分析，通过OTU聚类和SILVA数据库比对研究群落结构和动态。样本来源于四川省道孚县八美镇（青藏高原东南缘，海拔2992米）收获的全株玉米。

发酵品质分析

发酵参数分析显示，温度和添加剂交互作用对pH值、LA、AA和PA浓度有显著影响（P<0.05）。在15°C低温条件下，与对照相比，YZ3接种在整个发酵过程中表现出显著更高（P<0.05）的LA含量以及更低的pH值和PA含量。在90天时，YZ3处理组的pH值和PA含量最低，LA含量最高。相比之下，LPC接种在25°C下显示出更优的LA生产能力。YZ3处理在低温下有效抑制了AA和PA的产生，且所有处理组仅检测到微量BA（<0.1%），表明未发生梭菌发酵。

化学成分分析

在发酵90天后，对化学成分的分析表明，温度和添加剂交互作用对WSC和ADF浓度有显著影响（P<0.05）。在15°C下，YZ3处理组的WSC保存率最高（4.68%），显著优于其他处理（P<0.05），同时其ADF含量也显著低于LPC处理（P<0.05）。LPC处理在15°C和25°C下均表现出显著更低的NDF含量（P<0.05），这可能与其更强的纤维降解酶活性有关。在25°C下，添加剂处理组的ADF含量显著高于对照（P<0.05）。

细菌群落结构动态

Alpha多样性分析显示，在90天时，LPC处理青贮的Shannon和Chao1指数显著高于对照和YZ3处理。主坐标分析表明，在30天时，YZ3处理青贮的细菌群落与其他处理不同；而在90天时，LPC处理青贮的细菌群落与其他处理区分开。在属水平上，发酵青贮以乳酸植杆菌属（Lactiplantibacillus）为优势菌属。在15°C下，YZ3处理在发酵30天时乳酸植杆菌属的相对丰度高于对照；在60天和90天时，其相对丰度高于所有其他处理。进一步物种水平分析发现，在15°C下，YZ3添加剂处理青贮的植物乳杆菌（L. plantarum）相对丰度（60.02%、47.40%、41.11%）显著高于其他处理。相关性分析表明，乳酸植杆菌属的相对丰度与LA含量呈正相关，与pH值、氨态氮、AA、PA和BA呈负相关。

预测的细菌代谢通路

通过PICRUSt对细菌功能谱的预测分析显示，在KEGG水平1上，“代谢”类别的相对丰度最高。在水平2上，与氨基酸、碳水化合物、能量以及辅因子/维生素相关的代谢通路占主导地位。值得注意的是，在15°C下，YZ3处理青贮的碳水化合物代谢通路相对丰度显著更高，尤其是在60天和90天。此外，在30天和60天时，YZ3处理青贮的氨基酸代谢通路相对丰度也显著高于其他处理。

本研究证实，接种自主筛选的耐冷副干酪乳酸杆菌YZ3能够有效改善低温（15°C）条件下全株玉米青贮的发酵品质，表现为乳酸含量显著提高，pH值和丙酸含量降低。其作用机制在于，YZ3接种促进了有益菌属乳酸植杆菌属（尤其是植物乳杆菌L. plantarum）的增殖，并在低温发酵后期维持了其相对丰度的稳定性。同时，YZ3还通过增强青贮发酵早期（30-60天）的氨基酸代谢和维持后期高效碳水化合物代谢，优化了微生物的代谢功能。这些发现揭示了YZ3菌株作为一种有效的接种剂，通过调控微生物群落结构和功能代谢，提升低温环境下青贮发酵效率的潜力。该研究为解决高寒地区饲草保鲜难题、优化全株玉米等重要作物在挑战性低温环境下的保存提供了创新性的技术方案和理论依据，对促进寒冷地区可持续畜牧业发展具有重要意义。论文发表于《BMC Plant Biology》。