靶向长读长测序系统全面评估印迹障碍相关基因差异甲基化区域DNA甲基化模式

《Genome Medicine》：A comprehensive long-read sequencing system to assess DNA methylation at differentially methylated regions and imprinting-disorder-related genes

本研究针对当前缺乏全面覆盖印迹障碍相关区域的靶向长读长测序系统这一问题，开发了靶向78个DMRs和22个基因的T-LRS技术体系，通过6例健康对照建立了各CpG位点的甲基化指数正常范围，将DMRs分类为Complete/Partial/Non-DMRs三类，并在MLID患者中验证了该系统可同步检测致病性变异和甲基化异常，为印迹障碍的精准诊断提供了创新工具。

　　

在基因组印记这一特殊遗传现象中，基因表达呈现亲本来源特异性，而差异甲基化区域作为印记控制中心，其DNA甲基化模式的异常会导致多种印迹障碍。当前临床诊断面临重大挑战：传统甲基化分析方法如MS-MLPA、焦磷酸测序等存在局限性，它们需要额外的样本处理步骤（如亚硫酸氢盐转化），且无法区分亲本等位基因特异性甲基化模式，更重要的是，现有技术难以全面覆盖所有已知ID相关区域。随着多基因座印迹紊乱病例的不断发现，临床对能够同步分析序列变异和甲基化状态的高通量检测方法需求日益迫切。

牛津纳米孔技术提供的长读长测序技术，能够获得10-100 kb长度的序列读长并同时检测每个CpG位点的5-甲基胞嘧啶修饰，而靶向长读长测序通过自适应采样技术实现目标区域富集，大幅提高了测序效率。然而，此前尚无能够覆盖所有ID相关区域的完整T-LRS系统。

本研究建立了一个全面的T-LRS系统，靶向78个DMRs和22个基因，覆盖约1.2%的基因组区域。研究团队首先在6名健康对照者的外周血白细胞中进行T-LRS分析，设定每个CpG位点的甲基化指数正常范围。通过比较单倍型间CpG位点的MI差异，将78个DMRs分为Complete-DMRs（33个）、Partial-DMRs（25个）和Non-DMRs（20个）三类。为验证系统实用性，研究人员对两名已知携带MLID致病基因变异（ZNF445和NLRP2）的患者进行T-LRS分析，并与芯片甲基化分析结果进行比较。

技术方法主要包括：纳米孔靶向长读长测序（使用MinION或PromethION测序仪）、甲基化信息分析（使用Modkit工具）、单倍型分型（基于SNP和indel变异）、以及甲基化指数计算和差异分析。样本来源包括6名健康对照者和11名患者（2名MLID患者和9名疑似印迹障碍病例）的外周血白细胞DNA。

正常范围设定与DMRs特性分析

研究结果显示，所有DMRs中具有5mC和未甲基化胞嘧啶的读长中位数超过40。通过设定每个等位基因和总体的MI正常范围，研究人员首次系统性地描述了78个DMRs的甲基化特征。值得注意的是，15个临床相关DMRs中，除IGF2:Ex9-DMR、IGF2:alt-TSS-DMR和MEG3/DLK1:IG-DMR外，其余均被归类为Complete-DMRs，显示出明显的等位基因特异性甲基化差异。

甲基化模式比较验证

在MLID患者中，T-LRS成功检测到ZNF445和NLRP2的致病性变异，且甲基化异常模式与芯片分析结果基本一致，但T-LRS发现了更多异常甲基化的DMRs。例如，在患者1中，T-LRS除确认了H19-DMR低甲基化、MEG3:TSS-DMR低甲基化和MEG8:Int2-DMR高甲基化外，还额外检测到PPIEL:Ex1-DMR、DIRAS3:TSS-DMR等多个DMRs的甲基化异常。

病例验证与应用

在9例疑似印迹障碍病例中，T-LRS系统成功实现了表观遗传学诊断。例如，病例1通过检测MEG3:TSS-DMR高甲基化、MEG8:Int2-DMR低甲基化以及染色体14杂合性缺失，确诊为Kagami-Ogata综合征伴父源等位基因单亲二体；病例2检测到GNAS:A/B-DMR低甲基化和STX16杂合微缺失，确诊为假性甲状旁腺功能减退症1B型。

技术重复性评估

通过重复实验验证，T-LRS系统在相同样本中显示出高度的MI重复性，三个对照样本的MI相关性均极高，证明了该技术的可靠性。

本研究建立的T-LRS系统首次实现了对全部ID相关区域的全面覆盖，能够同步获取序列信息和单分子甲基化数据。与传统方法相比，该系统无需亚硫酸氢盐处理，可直接检测5mC修饰，且通过单倍型分型能够明确区分父源和母源等位基因的甲基化状态。研究不仅设定了每个CpG位点的正常MI范围，还首次基于等位基因间甲基化差异对DMRs进行了系统分类。

该技术的优势在于其全面性和高效性：一次检测即可替代传统需要多种技术组合才能完成的诊断流程，特别适用于临床表现不典型或涉及多基因座的复杂病例。此外，该系统可灵活扩展新的靶区域，适应不断增长的印迹障碍相关知识。

然而，当前T-LRS成本较高（约1600美元/样本），且部分区域覆盖度有待提高。未来随着测序技术成本降低和生物信息学分析流程优化，T-LRS有望成为印迹障碍诊断的主流方法。该系统不仅为临床诊断提供了强大工具，也为深入研究印记区域的调控机制奠定了基础。

本研究由日本国立成育医疗研究中心主导，发表于《Genome Medicine》杂志，为印迹障碍的精准医疗提供了重要技术支撑，标志着表观遗传学诊断进入了一个新的发展阶段。