EGFR通过调控SAV1降解促进YAP信号通路驱动糖尿病视网膜纤维化的机制研究

《Journal of Translational Medicine》：The epidermal growth factor receptor regulates YAP signalling and promotes diabetic retinal fibrosis by modulating the degradation of SAV1

本研究针对糖尿病视网膜纤维化的治疗难题，揭示了EGFR通过促进E3连接酶Herc4介导的SAV1降解进而抑制Hippo通路、激活YAP核转位的关键机制。研究人员采用EGFR抑制剂厄洛替尼和抗EGFR抗体干预糖尿病模型，证实靶向EGFR可有效缓解视网膜纤维化病变，为糖尿病视网膜病变提供了新的治疗靶点。

　　

当糖尿病悄然侵蚀视网膜的微环境，一种名为纤维化的病理过程便会悄然启动，最终导致不可逆的视力丧失。这种病变以细胞外基质（ECM）的过度沉积为特征，形成牵拉性视网膜脱离的结构基础。尽管抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法在治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性（nAMD）方面取得进展，但视网膜纤维化的存在往往使治疗效果大打折扣。目前，临床上仍缺乏有效阻止这一进程的手段。

在视网膜纤维化的复杂细胞网络中，Müller细胞扮演着核心角色。这些正常情况下维持视网膜稳态的胶质细胞，在疾病状态下会转化为具有收缩能力的肌成纤维细胞样细胞，表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），积极参与纤维化过程。先前的研究已经揭示了Yes相关蛋白（YAP）在糖尿病视网膜纤维化中的重要性，特别是通过PI3K/Akt/YAP信号通路介导的Müller细胞活化。然而，调控这一过程的上游机制仍不明确。

与此同时，表皮生长因子受体（EGFR）作为跨膜酪氨酸激酶受体，在多种纤维化疾病中显示出促纤维化作用。有趣的是，最近的研究发现EGFR缺失会显著降低心肌细胞中YAP的蛋白和mRNA水平，暗示着这两个通路之间可能存在直接对话。那么，在糖尿病视网膜中，EGFR是否通过调控Hippo-YAP通路来驱动纤维化？特别是，它是否影响Hippo通路核心组分——Salvador（SAV1）的稳定性？这些科学问题促使Wei Zhang团队在《Journal of Translational Medicine》上发表了他们的最新发现。

为了深入探索这一机制，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究以人视网膜Müller细胞（MIO-M1）为体外模型，通过Flag标签质粒转染和siRNA干扰分别实现EGFR的过表达和敲低；利用免疫共沉淀（Co-IP）和Western blotting分析蛋白质相互作用和表达变化；通过免疫荧光（IF）染色进行蛋白共定位分析；建立链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠模型，并分别采用腹腔注射EGFR抑制剂厄洛替尼和玻璃体内注射抗EGFR抗体进行干预；通过免疫组织化学（IHC）染色和Masson三色染色评估视网膜纤维化程度。

EGFR interacts with SAV1 and promotes YAP activation

研究人员首先在MIO-M1 Müller细胞中证实了EGFR与SAV1之间存在物理相互作用。免疫共沉淀实验显示，内源性SAV1能够与内源性EGFR以及过表达的Flag-EGFR发生共沉淀。免疫荧光染色进一步揭示两者在Müller细胞质中共定位。功能上，EGFR过表达导致YAP蛋白水平上升和SAV1水平下降，而抑制EGFR表达则产生相反效果，表明EGFR抑制了Hippo信号通路。亚细胞分级分析显示，EGFR过表达促进YAP核转位，增强了下游靶基因CTGF和CYR61的mRNA表达。

EGFR mediates SAV1 proteasomal degradation

接下来，团队深入探索了EGFR调控SAV1的具体机制。qPCR结果显示EGFR不影响SAV1的mRNA表达，但蛋白水平上，EGFR过表达以剂量依赖方式降低内源性SAV1蛋白。这种降解可被蛋白酶体抑制剂MG132阻断，表明SAV1通过蛋白酶体途径被降解。环己酰亚胺追踪实验进一步证实，EGFR过表达显著缩短SAV1蛋白的半衰期，而抑制EGFR则延长其半衰期。

EGFR mediates SAV1 degradation through promoting its binding to Herc4

由于Herc4是已知的SAV1 E3泛素连接酶，研究人员假设EGFR可能通过促进SAV1与Herc4的结合来介导其降解。实验证实EGFR与Herc4存在相互作用和共定位。更重要的是，两步免疫共沉淀实验显示EGFR、SAV1和Herc4可形成三元复合物。EGFR过表达增强SAV1与Herc4的结合，而抑制EGFR则削弱这种相互作用。功能挽救实验表明，敲低Herc4可部分逆转EGFR过表达引起的SAV1降解和YAP激活，证实Herc4在此过程中的必要性。

Inhibition of EGFR suppresses YAP activation and alleviates diabetic retinal fibrosis

在动物模型中，糖尿病小鼠视网膜组织显示EGFR和YAP表达上调，SAV1表达下调。腹腔注射EGFR抑制剂厄洛替尼可逆转这些变化，降低YAP核水平，增加SAV1表达。同时，厄洛替尼治疗上调上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin），下调间质标志物波形蛋白（vimentin）及纤维化标志物α-SMA和纤连蛋白（fibronectin）。Masson染色显示厄洛替尼显著减少糖尿病小鼠视网膜前纤维膜的形成。体外实验进一步证实，YAP过表达可挽救EGFR抑制引起的α-SMA和胶原蛋白I（collagen I）表达下降，表明EGFR通过Hippo/YAP通路调控视网膜纤维化。

EGFR blockade inhibits diabetic retinal fibrosis

最后，研究人员评估了玻璃体内注射抗EGFR抗体的治疗潜力。无论是糖尿病诱导后立即开始预防性治疗，还是6周后开始干预性治疗，抗EGFR抗体均能有效抑制视网膜纤维化。早期开始、多次给药的方案效果更佳，表现为α-SMA、CTGF和胶原蛋白I表达显著降低，视网膜前纤维膜形成减少。

本研究揭示了一条全新的EGFR-Herc4-SAV1-YAP信号轴在糖尿病视网膜纤维化中的核心作用。EGFR作为分子支架，促进E3连接酶Herc4与SAV1的结合，从而通过蛋白酶体途径降解SAV1，解除Hippo通路对YAP的抑制，导致YAP核转位和下游纤维化基因的激活。这一机制不仅深化了对生长因子受体与Hippo通路交叉对话的理解，更重要的是提供了明确的治疗靶点。研究证明，无论是系统性还是局部抑制EGFR，都能有效缓解糖尿病视网膜纤维化，且早期干预效果更佳。这些发现为开发针对糖尿病视网膜病变及其他纤维化疾病的新疗法奠定了坚实的理论基础，具有重要的临床转化价值。