综述：守护青蒿素：整合生物生产创新与耐药性管理以实现疟疾消除

《Malaria Journal》：Safeguarding artemisinin: integrating bioproduction innovation and resistance management for malaria eradication

本综述系统阐述了青蒿素（ART）在疟疾防治中面临的双重挑战：生物生产瓶颈与耐药性蔓延。文章深入探讨了通过代谢工程（如在烟草、苔藓等异源宿主中重建ART生物合成途径）和农业优化提升产量的策略，同时聚焦于恶性疟原虫Kelch 13蛋白（PfK13）基因突变介导的ART耐药性分子机制。文章批判性评估了现有青蒿素联合疗法（ACT）及新型三重（TACT）、四重（QACT）联合疗法的优劣与地域适用性，强调跨学科合作是保障ART长期效力的关键。

　　

背景

疟疾仍然是全球重大的公共卫生威胁，尤其对热带地区，特别是非洲人口影响巨大。仅2023年，全球就有约2.63亿疟疾病例和59.7万死亡病例。恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是致死性最强的一种疟原虫，通过受感染的雌性按蚊叮咬传播。青蒿素（Artemisinin, ART）是一种从植物青蒿（Artemisia annua）腺毛中提取的含有15个碳原子的脂溶性倍半萜内酯，已成为抗疟治疗的基石。其疗效不仅限于疟疾治疗，还显示出潜在的抗肿瘤、抗病毒，甚至抗SARS-CoV-2的活性。

青蒿素的发现源于中国的“523项目”，由屠呦呦教授领导的研究团队在20世纪70年代从青蒿提取物中鉴定出其高效抗疟活性，屠呦呦也因此荣获2015年诺贝尔生理学或医学奖。到20世纪70年代末，青蒿素被确立为一线抗疟药，用于应对氯喹等药物日益严重的耐药性问题。

青蒿素生物合成与生产挑战：从植物腺毛到细胞工厂

青蒿素主要在青蒿叶片和花结构的腺毛中与青蒿乙素（Arteannuin B, ARB）共同合成。其生物合成途径属于萜类生物合成途径，前体异戊二烯单元分别来源于细胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径和质体中的2-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径。

途径起始于异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）缩合生成法尼基焦磷酸（FPP）。FPP在紫穗槐-4,11-二烯合成酶（ADS）的催化下环化生成紫穗槐-4,11-二烯（amorphadiene），这是青蒿素生物合成的第一个关键步骤。随后，细胞色素P450羟化酶（CYP71AV1）将紫穗槐-4,11-二烯逐步氧化为青蒿醇、青蒿醛，并进一步氧化为青蒿酸。青蒿醛是一个分支点：它既可以被青蒿醛△11(13)双键还原酶（DBR2）还原为二氢青蒿醛，再经醛脱氢酶1（ALDH1）氧化为二氢青蒿酸（DHAA）；也可以通过CYP71AV1和ALDH1的作用生成青蒿酸。最近鉴定出的青蒿二氢青蒿酸脱氢酶（AaDHAADH）提供了青蒿酸与DHAA之间双向转化的直接酶促途径。最后，二氢青蒿酸和青蒿酸在紫外光和氧气存在下发生非酶促氧化，分别生成青蒿素和青蒿乙素。

农业优化

青蒿素产量受基因型（如干重含量≥2%的杂交种）、光周期和光质（补充16小时绿光和UV-B光分别使腺毛密度增加11%和9%）以及诱导子（壳聚糖使ART提高53%）等因素影响。四倍体诱导（产量增加56%）、利用内生菌群以及精准农业（叶面喷施硒+纳米硅：ART提高1.4倍）是可在田间应用的策略范例。

生物技术与化学创新

青蒿的代谢工程

在青蒿中，通过农杆菌介导的转化系统将青蒿素生物合成相关基因转入，旨在提高转基因植物的青蒿素含量。先进策略包括增强代谢流、阻断竞争途径以及利用转录因子（TFs）提高产量。共转化生物合成途径基因和腺毛特异性转录因子可显著增加青蒿素含量。

转录因子（TFs）调控

转录因子在调控青蒿腺毛密度和青蒿素生产中起关键作用。R2R3 MYB转录因子TLR1和TLR2是腺毛密度和青蒿素水平的负调控因子。相反，bHLH转录因子AaMYC2型则对腺毛密度和青蒿素生物合成产生积极影响。AP2转录因子TAR1和MYB转录因子TAR2也是腺毛发育和青蒿素生产的正调控因子。WRKY转录因子AaGSW1通过调控关键生物合成基因特异性促进腺毛中的青蒿素生物合成。这些发现揭示了转录因子在调控腺毛密度和青蒿素生物合成中的复杂相互作用，为通过遗传操作提高青蒿素产量提供了潜在靶点。

异源生产系统

在异源宿主中生产青蒿素及其前体已取得显著进展。在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中，通过农杆菌浸润技术表达生物合成基因，可产生青蒿素前体。引入紫穗槐-4,11-二烯合成酶可产生紫穗槐-4,11-二烯。此外，引入青蒿特有的脂质转移蛋白可通过阻止前体化合物回流入细胞来增强其积累。

在小立碗藓（Physcomitrella patens）中，通过用完整的青蒿素生物合成基因集改造苔藓，开发了一个稳定且可扩展的青蒿素生产平台，成功实现了青蒿素的植物体内生物合成，且无需进一步修饰，初始产率较高。将完整生物合成途径整合到小立碗藓中表明，该苔藓有能力用其内源酶补充青蒿素途径，从而生产青蒿素及相关化合物如青蒿乙素。

青蒿素及其前体的半合成与微生物生产

青蒿素及其前体的异源生产已从学术研究走向工业化规模生产，最著名的例子是通过半合成工艺商业化生产半合成青蒿素。这一里程碑式的成就证明了大规模供应关键药物成分的重要性。除了这条商业途径，各种微生物宿主的优化也在持续进行。在大肠杆菌（Escherichia coli）中，通过工程化合成紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因和来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲羟戊酸类异戊二烯途径，实现了青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯的生产。在酿酒酵母中，通过工程化MEV途径和引入新型细胞色素P450单加氧酶（CYP71AV1），实现了青蒿酸的生产。此外，也探索了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）通过乙酰辅酶A途径和内源MEV途径生产紫穗槐-4,11-二烯的潜力。在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中，通过上调植物来源的紫穗槐-4,11-二烯合成酶和优化关键酶的表达，提高了紫穗槐-4,11-二烯的产量。土曲霉（Aspergillus terreus）已被用于青蒿素的微生物转化，生产诸如1-脱氧青蒿素等衍生物。

青蒿素耐药性的出现

遗传驱动因素

恶性疟原虫对包括青蒿素在内的抗疟药产生耐药性，严重威胁全球疟疾控制和消除努力。青蒿素耐药性（ART-R）的出现主要通过选择具有特定单点突变的寄生虫，这些突变缩短了寄生虫的环状体期，从而削弱了青蒿素的效力。

恶性疟原虫Kelch 13蛋白β-螺旋桨结构域（PfK13）的突变已被确定为青蒿素耐药性的主要决定因素。K13蛋白与Kelch/BTB/POZ泛素化衔接子同源，这些衔接子与Cullin-3 E3泛素连接酶共同调节靶蛋白的泛素化，影响内吞、膜运输、转录和细胞周期进程等重要细胞过程。

K13定位于胞口，促进血红蛋白的摄取，这是寄生虫获取氨基酸的关键过程。在血红蛋白消化过程中，有毒的血红素被解毒成疟色素。青蒿素会破坏这一途径，但耐药性突变（尤其是常见的C580Y变异体）会减弱血红蛋白的内吞作用，改变蛋白质结合亲和力，并提高特定寄生虫蛋白的水平。这些适应性变化中和了青蒿素的效力。

全球监测

青蒿素耐药性的全球监测至关重要，因为耐青蒿素的恶性疟原虫正在不断扩散，特别是在东南亚和非洲部分地区。在东南亚，尤其是大湄公河次区域，耐药性已被充分记录，特定的K13突变（如C580Y）普遍存在，导致寄生虫清除延迟。在非洲，尽管耐药性不如东南亚广泛，但已有与寄生虫清除时间延长相关的K13突变（如A675V和C469Y）的报道。通过基因组研究和快速诊断工具（如基于qPCR的检测方法）的开发，监测工作正在加强，这有助于在资源有限的环境中也能够检测耐药性。全球遏制青蒿素耐药性的努力包括绘制K13突变分布图，以及实施防止耐药株传播的策略，如使用联合疗法和加强监测系统。

治疗策略：从ACT到QACT

ACT：疗效与局限性

为降低疟疾复发风险，当前国际指南要求使用至少两种具有不同作用机制和细胞靶点的抗疟药。世界卫生组织（WHO）推荐将青蒿素联合疗法（ACT）作为存在确诊青蒿素耐药性地区的一线治疗方案。

ACT通过将一种短效的青蒿素衍生物（可快速减少寄生虫生物量并缓解急性临床症状）与一种长效的伴侣药物（旨在清除残余寄生虫并防止再燃）相结合而发挥作用。尽管ACT在历史上取得了成功，但对青蒿素和伴侣药物均产生耐药性的寄生虫的出现，日益损害了ACT的疗效，导致多个地区治疗失败率上升。特别令人担忧的是，有证据表明，在ACT方案中预先存在的青蒿素敏感性降低，可能会在某些流行病学环境下加速伴侣药物耐药性的发展。

在喀麦隆、坦桑尼亚、塞内加尔和刚果民主共和国等国的临床评估表明，ACT仍保持高效，PCR校正治愈率常超过90%。然而，在东南亚，青蒿素耐药性对疟疾控制构成了重大威胁。相比之下，在许多非洲地区，由于缺乏经过验证的耐药性标记物，青蒿素联合疗法仍保持其治疗有效性。

ACT的持续局限性包括成本高、在资源有限地区可及性不均，以及针对孕妇和儿童等脆弱人群的安全性数据不足。此外，由预先存在的青蒿素耐药性促进的伴侣药物加速耐药的可能性，凸显了持续分子监测和开发下一代抗疟策略的迫切需求。

TACTs/QACTs：平衡收益与风险

为应对ACT耐药性，提出了三重青蒿素联合疗法（TACT），即在现有ACT组分基础上加入一种具有中等半衰期和互补保护效应的额外伴侣药物。这种方法旨在实现“单次接触根治和预防疗法”（SERCAP）。通过靶向寄生虫生命周期中的多个薄弱环节，TACT可降低从头产生耐药性的可能性，使其成为确诊ACT耐药性地区的关键干预措施。

然而，随着ACT耐药性在流行地区的持续演变，未来出现对TACTs耐药性的可能性仍然是一个重大关切。尽管初步研究强调了第四线伴侣药物的效力，但未来可能需要对四重青蒿素联合疗法（QACT）的需求。

地理上耐药性模式的差异性导致WHO倡导针对特定地区的治疗协议。在ACT仍然基本有效的非洲，部署TACT可先发制人地遏制耐药性升级；然而，在实施之前必须解决伦理、监管和市场准入障碍。TACT在非洲国家的采用将取决于其相对于现有青蒿素联合疗法的明显优越性、WHO的有力倡导以及与当前分发框架的兼容性。QACT显示出与三重疗法相当的疗效和安全性，但其在疟疾管理中的相关性需要通过针对性研究进一步论证。

结论与未来方向

对抗疟疾的斗争取决于两个关键方面：通过代谢工程和合成生物学扩大青蒿素生产规模，以及通过空间适应性治疗策略延缓耐药性出现。新兴工具，如基因组编辑宿主、PfK13抑制剂和药物组合，带来了希望。优先考虑公平可及性和耐药性监测将决定青蒿素是继续作为“银弹”还是屈服于进化必然性。