肺共生乳酸菌通过激活Vy4+ γδ T细胞分泌IL-17A增强抗细菌性肺炎能力

《Microbiome》：The pulmonary commensal Lactobacillus regulated lung γδ T cells to enhance resistance against bacterial infections

本研究针对长期抗生素使用导致宿主易感性增加的问题，探讨了肺共生微生物在调节免疫防御中的作用。研究人员发现，肺源乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum和Lactobacillus murinus）可通过其代谢产物胞外多糖激活肺部Vy4+ γδ T细胞，促进IL-17A分泌，从而增强对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染的抵抗力。该研究揭示了肺微生物群-γδ T细胞-IL-17A轴在抗感染免疫中的新机制，为益生菌干预肺部感染提供了理论依据。

　　

抗生素的广泛应用在对抗病原菌的同时，也带来了一个棘手的问题——它们不仅清除有害菌，还会破坏人体内有益的共生微生物群。近年来，随着耐药菌株如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和铜绿假单胞菌的不断出现，细菌性肺炎的发病率和死亡率呈上升趋势。更令人担忧的是，临床观察发现，抗生素治疗有时反而会增加患者对继发感染的易感性，这提示我们，共生微生物在维持免疫稳态和防御感染中可能发挥着关键作用。

长期以来，科学界对肠道微生物的研究取得了丰硕成果，而对肺部微生物的关注相对较少。过去曾认为肺部是无菌环境，但随着高通量测序技术的发展，研究人员发现健康人的肺部同样存在着一个动态的微生物生态系统。研究表明，无菌小鼠或抗生素处理的小鼠对肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌等病原体更易感，这表明肺部微生物群对抵抗呼吸道感染至关重要。然而，肺共生微生物如何与局部免疫系统相互作用，特别是如何调控抗金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染的深层机制，仍不清楚。

γδ T细胞是一类异质性T淋巴细胞亚群，主要分布于皮肤、肠道和肺部等黏膜屏障部位。在肺部，γδ T细胞通过分泌基础细胞因子参与局部生理活动，并在病原体入侵时快速启动炎症反应。其中，Vy4⁺ γδ T细胞和Vy6⁺ γδ T细胞是肺部抗感染的主要亚群。白介素-17（IL-17）是炎症、黏膜感染宿主防御和维护黏膜屏障完整性的关键分子。在炎症过程中，IL-17能诱导上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞产生促炎细胞因子、趋化因子、抗菌肽和基质金属蛋白酶，从而刺激IL-8和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的表达，促进中性粒细胞的产生和迁移至感染部位，放大免疫反应。γδ17 T细胞（即产生IL-17的γδ T细胞）是黏膜组织（包括肺部）早期IL-17的主要来源，在抵抗细菌和真菌感染中起保护作用。越来越多的证据表明，微生物群与γδ T细胞之间存在双向调节，尤其是在黏膜组织中，这些细胞与共生菌和病原菌相互作用。微生物群影响γδ T细胞的分化和活化，例如Vy4⁺ γδ17 T细胞的分化依赖于特定的微生物群落。然而，具体是哪些共生菌参与这一过程，以及它们如何调控肺部γδ T细胞功能以增强抗感染免疫力，尚待阐明。

发表在《Microbiome》上的这项研究，首次报道了肺共生乳酸杆菌，特别是植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，能够激活Vy4⁺ γδ T细胞分泌IL-17A，从而减轻对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染的易感性。此外，研究还鉴定出植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的代谢产物——胞外多糖（EPS），是关键的免疫调节分子。这项研究强调了肺共生菌在调节抗感染免疫中的重要性，并为临床研究肺微生物群在抗感染中的作用提供了理论基础。

为开展本研究，研究人员运用了多项关键技术方法：使用SPF级C57BL/6小鼠以及γδ T细胞基因敲除（TCR δKO）和IL-17A基因敲除（IL-17AKO）小鼠建立动物模型；通过长期（21天）混合抗生素（氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、万古霉素）饮水建立肺微生物群紊乱模型；采用肠道微生物群移植（FMT）和鼻内递送支气管肺泡灌洗液（BALF）或特定分离菌（如乳酸杆菌）进行微生物群重建；利用16S rDNA测序分析肠道和肺部微生物群落组成；通过RNA测序（RNA-seq）进行肺组织转录组学分析；采用流式细胞术检测肺组织免疫细胞亚群（如γδ T细胞、中性粒细胞）及其胞内细胞因子（IL-17A）；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量肺组织匀浆中细胞因子（IL-17A, CXCL1, CXCL2, IL-1β, IL-23）水平；使用特异性中和抗体体内耗竭特定免疫细胞亚群（如Vy2⁺或Vy4⁺ γδ T细胞）或阻断细胞因子（IL-1β, IL-23）功能；从乳酸杆菌培养上清中提取和纯化胞外多糖（EPS），并体外评估其对分离的肺γδ T细胞分泌IL-17A的影响。

长期抗生素预暴露增强了细菌性肺炎的易感性

研究人员首先建立了长期广谱抗生素暴露小鼠模型（ABX小鼠），以模拟临床中抗生素使用导致的微生物群紊乱。与未使用抗生素的小鼠（No ABX）相比，ABX小鼠在鼻内感染金黄色葡萄球菌（S. aureus USA300）或铜绿假单胞菌（P. aeruginosa PAO1）后，存活率显著降低，肺组织和BALF中的细菌负荷显著升高。这表明长期抗生素处理破坏了共生微生物群，导致宿主对细菌性肺炎的易感性增加。

共生菌以IL-17A依赖的方式增强肺部免疫力

进一步分析发现，ABX小鼠肺部IL-17A的基础水平和感染后的诱导水平均显著低于No ABX小鼠。转录组分析也证实ABX小鼠肺中il17a基因表达下调。为了验证IL-17A的关键作用，研究人员给ABX小鼠鼻内补充重组IL-17A（rIL-17A），结果发现这能显著提高ABX小鼠感染后的存活率并降低肺内细菌负荷。相反，IL-17A基因敲除（IL-17AKO）小鼠表现出与ABX野生型小鼠相似的高易感性。这些结果表明，微生物群通过IL-17A依赖的机制抵抗细菌感染。

肺源的植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌增强对细菌感染的呼吸防御

为了探究是肠道还是肺部的微生物群在抵抗肺部感染中起主导作用，研究人员分别将健康小鼠的肠道内容物（口服）或BALF内容物（鼻内）转移给ABX小鼠。结果发现，两种方式都能部分恢复ABX小鼠的抗感染能力，但鼻内转移肺部微生物群的效果更佳，提示肺局部共生菌具有更直接的保护作用。通过分析不同抗生素组合（针对革兰氏阳性菌的氨苄青霉素+万古霉素，以及针对革兰氏阴性菌的氯霉素+新霉素）处理的小鼠，发现革兰氏阳性菌的缺失与感染易感性增加密切相关。16S rDNA测序显示，ABX小鼠肺部和肠道中的乳酸杆菌（尤其是植物乳杆菌）丰度显著降低。随后，研究人员从SPF小鼠肺部分离出多种共生菌，包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、阴道乳杆菌、漳州芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。鼻内转移实验表明，只有植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌能显著提高ABX小鼠对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染的抵抗力，表现为存活率提高和肺内细菌负荷降低。体外共培养实验排除了这两种乳酸杆菌通过直接抑制病原菌生长起作用的可能性。

植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌通过IL-17A依赖的方式增强呼吸防御

RNA测序和ELISA检测显示，ABX小鼠肺部IL-17A通路相关分子（如CXCL1, CXCL2, IL-1β, IL-23）的表达和分泌在感染前后均处于较低水平。而补充植物乳杆菌或鼠李糖乳杆菌可恢复这些分子的水平。相应地，补充了这两种乳酸杆菌的ABX小鼠感染后肺内中性粒细胞（IL-17A的关键效应细胞）募集增加。然而，当在IL-17AKO背景的ABX小鼠中补充植物乳杆菌或鼠李糖乳杆菌时，其保护作用消失，存活率和细菌清除能力与未补充菌的ABX小鼠无差异。这证实了植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的保护作用严格依赖于IL-17A。

共生菌植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌调节Vy4⁺ γδ T细胞对抗细菌感染

流式细胞术分析发现，ABX小鼠肺部IL-17A⁺ γδ T细胞的数量显著减少，而IL-17A⁺ CD4⁺ T细胞、ILC3细胞或NKT细胞则无明显变化。补充植物乳杆菌或鼠李糖乳杆菌能特异性恢复ABX小鼠肺部IL-17A⁺ γδ T细胞的数量。更重要的是，在γδ T细胞缺陷（TCR δKO）的ABX小鼠中，补充这两种乳酸杆菌无法提供保护作用，其感染后肺损伤严重，细菌负荷高，且肺部IL-17A水平无显著提升。进一步亚群分析揭示，抗生素处理主要减少了IL-17A⁺ Vy4⁺ γδ T细胞，而对IL-17A⁺ Vy2⁺ γδ T细胞影响不大。体内抗体耗竭实验证实，中和Vy4⁺ γδ T细胞会显著增加野生型小鼠的死亡率和细菌负荷，并降低肺部IL-17A水平；而中和Vy2⁺ γδ T细胞则无此效应。这表明肺共生乳酸杆菌主要通过调节Vy4⁺ γδ T细胞来发挥其免疫保护作用。

乳酸杆菌共生菌的胞外多糖激活Vy4⁺ γδ T细胞分泌IL-17A

机制探索表明，乳酸杆菌的免疫调节作用需要IL-1β和IL-23的参与，因为中和这两种细胞因子会取消植物乳杆菌或鼠李糖乳杆菌提供的保护。研究人员进而关注了乳酸杆菌的代谢产物。他们从植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的培养上清中纯化出了胞外多糖（EPS）。体外实验表明，这两种EPS能以剂量依赖的方式激活从小鼠肺中分离的γδ T细胞产生IL-17A，且此激活作用依赖于IL-23和IL-1β的存在。体内实验发现，鼻内给予ABX小鼠EPS（而非作为对照的L-乳酸），能显著增加肺内IL-17A⁺ Vy4⁺ γδ T细胞的数量，并提高小鼠感染后的存活率，降低肺内细菌负荷和病理损伤，促进中性粒细胞募集。而补充L-乳酸则无此效果。这证明EPS是乳酸杆菌激活Vy4⁺ γδ T细胞的关键效应分子。

研究结论与意义

本研究系统阐明了肺共生微生物群，特别是植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，在维持肺部免疫稳态和防御细菌性肺炎中的关键作用。研究首次揭示了由肺共生菌来源的胞外多糖（EPS）—IL-1β/IL-23—Vy4⁺ γδ T细胞—IL-17A轴构成的抗感染免疫新通路。该通路在抗生素扰乱微生物群后被削弱，导致宿主易感性增加，而通过补充特定益生菌或其活性代谢物EPS可重建该免疫防御功能。

这项研究的具有重要意义：首先，它深化了对肺局部微生物群-免疫系统相互作用的理解，将研究视角从肠道微生物群拓展至肺部这一重要的黏膜器官。其次，研究明确了Vy4⁺ γδ T细胞作为肺共生菌调控IL-17A介导的先天免疫的核心细胞亚群，并鉴定出EPS是其关键的免疫调节分子，为精准免疫干预提供了靶点。第三，研究结果对临床实践具有重要启示：长期或广谱抗生素使用可能通过破坏肺微生物群而增加肺炎风险，提示在抗感染治疗中需关注微生物群的保护与重建。最后，该研究为开发基于益生菌（如特定乳酸杆菌）或其活性成分（如EPS）的微生态制剂或免疫佐剂，用于预防或辅助治疗耐药细菌引起的肺部感染，提供了坚实的理论依据和实验证据。未来的研究可进一步探索EPS调控Vy4⁺ γδ T细胞的具体分子受体和下游信号通路，并评估其在人类肺部感染中的潜在应用价值。