阿米巴分泌小分子蛋白通过Rcs双组分系统上调肺炎克雷伯菌荚膜基因表达的环境致病机制研究

《Parasites & Vectors》：Small excretory–secretory proteins of Acanthamoeba castellanii genotype T4 upregulate the expression of capsule-associated genes via the Rcs two-component system in Klebsiella pneumoniae

本研究针对水生环境中机会致病菌毒力进化机制这一重要科学问题，通过多学科技术手段揭示了阿米巴分泌蛋白诱导肺炎克雷伯菌荚膜增厚的分子通路。研究发现Acanthamoeba castellanii基因型T4（AcT4）分泌的<10 kDa小分子排泄-分泌蛋白（ESPs）能通过激活Rcs双组分系统（rcsB基因显著上调），独立于毒力质粒驱动荚膜合成关键基因（galF、wzi）表达，从而增强细菌对血清杀菌作用的抵抗力和对宿主细胞的毒性。该发现首次阐明了原生生物与细菌的接触非依赖性互作可诱发临床重要病原体的超强毒力表型，为水生环境作为超强毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）进化源头的风险评估提供了理论依据。

　　

在水生环境的微观世界里，两种常见的微生物——棘阿米巴原虫（Acanthamoeba castellanii）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）长期共存。这种共存关系远非简单的邻里相处，而是可能悄然改变细菌的致病特性。近年来，超强毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent K. pneumoniae, hvKp）的出现给临床感染防控带来严峻挑战，但其环境起源一直成谜。早先研究发现，棘阿米巴原虫基因型T4（AcT4）能诱导肺炎克雷伯菌荚膜增厚，暗示环境原生生物可能是hvKp的“训练场”，然而这一转变的分子机制始终笼罩在迷雾中。

为揭开这一谜题，Chuang等研究人员在《Parasites & Vectors》发表的最新研究中，系统解析了AcT4调控肺炎克雷伯菌荚膜合成的信号通路。通过一系列精巧的实验设计，团队发现阿米巴分泌的小分子蛋白（<10 kDa）能激活细菌表面的Rcs双组分系统，进而上调荚膜合成基因表达，最终增强细菌毒力。这一发现不仅揭示了病原体环境进化的新机制，更警示我们日常接触的水环境可能潜藏着意想不到的公共卫生风险。

关键技术方法概述

研究采用共培养实验比较AcT4处理前后肺炎克雷伯菌（临床分离株K-81，来源医院患者角膜）的表型变化；通过抗生素敏感性试验、乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测和血清抗性实验评估毒力改变；利用逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析荚膜相关基因（wzi、galF、rcsB、rmpA、rmpA2）表达；采用超速离心分离阿米巴排泄-分泌蛋白（ESPs）的>10 kDa和<10 kDa组分；使用自动化生化分析仪检测阿米巴条件培养基中离子浓度变化。

研究结果

AcT4互作增强肺炎克雷伯菌超强毒力和细胞毒性而不改变抗生素敏感性

通过药敏试验发现，与AcT4共培养后的肺炎克雷伯菌对庆大霉素（GM）、氯霉素、环丙沙星（CIP）、头孢他啶（CAZ）、亚胺培南（IPM）等5类抗生素的抑菌圈无显著变化，表明阿米巴诱导的转化不影响细菌耐药性。然而在细胞毒性实验中，AcT4诱导的菌株使人肺腺癌细胞（A549）的LDH释放量显著增加（P<0.01），提示其致病性增强。

AcT4增强肺炎克雷伯菌的血清抗性和存活能力

在正常人血清处理实验中，诱导组菌株在2小时（OD₆₀₀ 0.85 vs 0.45）、4小时（1.23 vs 0.95）和6小时（1.90 vs 1.55）的存活率均显著高于对照组（P<0.05或P<0.01）。菌落形成单位（CFU）计数结果进一步验证诱导菌对血清免疫因子具有更强抵抗力。

AcT4诱导的微环境应激通过离子重分布促进Rcs介导的肺炎克雷伯菌荚膜增大

基因表达分析显示，诱导组中Rcs双组分系统基因rcsB表达显著上调（P<0.001），荚膜合成基因galF和wzi也同步升高（P<0.001），但毒力质粒基因rmpA/rmpA2未被检测到。离子浓度检测发现阿米巴条件培养基中钠、钾、氯离子（与渗透压相关）以及铁离子浓度显著改变，提示微环境应激激活Rcs系统。

AcT4排泄-分泌蛋白中的小分子蛋白驱动肺炎克雷伯菌荚膜生物合成

研究发现阿米巴条件培养基能独立诱导荚膜增厚和wzi基因上调（P<0.001）。进一步将排泄-分泌蛋白（ESPs）按分子量分级后，仅<10 kDa组分能引发荚膜增大和wzi基因表达升高，表明小分子蛋白是主要活性成分。

结论与讨论

本研究首次证实AcT4分泌的<10 kDa小分子蛋白可通过激活Rcs双组分系统（非依赖毒力质粒）上调肺炎克雷伯菌荚膜合成基因表达。这一接触非依赖性互作机制揭示了水生环境中原生生物驱动细菌毒力进化的新途径，为临床hvKp的环境起源提供了关键证据。值得注意的是，铁离子浓度升高可能通过Fe-S依赖调控途径协同促进荚膜合成，而小分子ESP的具体成分仍有待蛋白质组学鉴定。该发现警示我们需重新评估水生环境作为病原体进化温床的潜在风险，为未来制定针对性防控策略奠定了理论基础。