泰国猫中“候选血微小支原体”谱系内隐藏的血浆原体物种：基于双基因标记分析的发现

《Parasites & Vectors》：Hidden hemoplasma species within the “Candidatus Mycoplasma haemominutum” lineage in Thai cats revealed by analyses of two independent genetic markers

本研究针对猫血源性支原体（血浆原体）物种鉴定困难的问题，通过联合分析16S和23S rRNA基因，对泰国家猫进行大规模筛查。研究发现17.5%的感染率，并首次在泰国猫中鉴定出两个与“候选血微小支原体”（CMhm）密切相关的潜在新物种，揭示了传统16S rRNA基因分析的局限性。该研究为复杂血浆原体群体的精确鉴定提供了新的分子流行病学依据，对理解病原多样性及制定有效防控策略具有重要意义。

　　

在猫科动物健康领域，有一类被称为血源性支原体（hemotropic Mycoplasma spp., 简称血浆原体hemoplasmas）的微小细菌长期受到关注。它们特异地寄生在红细胞表面，能够引发感染性溶血性贫血，不仅影响家猫（Felis catus）的健康，也在全球范围内的多种哺乳动物中均有发现。在猫身上，主要有三种公认的血浆原体物种：Mycoplasma haemofelis (Mhf)、“Candidatus Mycoplasma haemominutum” (CMhm) 和“Candidatus Mycoplasma turicensis” (CMt)。传统的物种鉴定和进化分析高度依赖于16S核糖体DNA（16S rDNA）序列。然而，这个基因在近缘物种间往往过于保守，导致区分能力有限，这就像试图用一把刻度不够精细的尺子去测量微小的差异，使得许多隐藏在已知物种名下的遗传多样性未被察觉。例如，之前有研究基于23S rRNA基因的分析，提示在CMhm谱系内可能存在新的物种。这个问题在泰国这样一个拥有丰富猫科动物种群的国家显得尤为重要，因为此前对当地猫血浆原体多样性的认识主要基于16S rRNA基因，其全貌很可能被低估了。

为了解决这一问题，由Kritsada Thongmeesee领衔的研究团队在《Parasites & Vectors》杂志上发表了一项研究，旨在利用更为灵敏的遗传标记，深入探究泰国猫群中血浆原体的真实多样性。研究人员设想，通过联合使用16S和23S rRNA基因作为独立的遗传标记进行综合分析，能够更清晰地揭示血浆原体物种间的界限，特别是挖掘出隐藏在CMhm谱系内的潜在新物种。

为了开展这项研究，研究人员汇集了388份猫的血液样本，这些样本来自朱拉隆功大学兽医诊断实验室。首先，他们成功提取了样本中的核酸。随后，采用针对16S rRNA基因的PCR（聚合酶链式反应） assay进行初步筛查，以确定血浆原体的感染情况。对于筛查出的阳性样本，研究人员进一步对它们的16S和23S rRNA基因片段进行测序。获得序列后，他们运用了一系列生物信息学工具进行深入分析：使用BLASTn（核苷酸基本局部比对搜索工具）进行初步同源性比对；使用DnaSP 6软件分析核苷酸序列类型（ntSTs）；使用MEGA X软件构建系统发育进化树，以明确各序列的进化地位；使用PopART软件构建遗传网络，直观展示序列间的遗传关系；并使用Sequence Demarcation Tool (SDT) 生成配对一致性矩阵，量化序列间的相似度。此外，还利用快速检测试纸对样本进行了猫白血病病毒（FeLV）和猫免疫缺陷病毒（FIV）的感染状态检测，并分析了这些因素与血浆原体感染之间的关联。

研究结果

血浆原体感染率与风险因素分析

对388份猫血液样本的筛查显示，共有68只猫（17.5%，95%置信区间[CI]为13.9%-21.7%）的血浆原体检测呈阳性。统计分析发现，感染状态与年龄、品种以及FIV感染状态显著相关。年龄越大，感染率越高；非纯种猫（混种猫/家养短毛猫）的感染率高于纯种猫；FIV抗体阳性的猫感染血浆原体的风险也显著更高。

基于16S rRNA基因的遗传多样性分析

从68份阳性样本中，成功对49份样本的16S和23S rRNA基因进行了测序，并鉴定出11种核苷酸序列类型（ntSTs）。基于16S rDNA的系统发育分析将序列划分为血微小原体组（Haemominutum group）和血丝原体组（Haemofelis group）。序列被归类到三种已知的猫血浆原体：Mhf、CMhm和CMt。其中，CMhm相关的序列（ntST#1-8）可进一步划分为至少三个组（A、B、C组），CMt相关序列（ntST#11）至少可划分为两个组。遗传网络分析也支持了这种分组模式。

基于23S rRNA基因的物种鉴别与潜在新物种发现

23S rDNA的分析提供了更高的分辨率。系统发育树同样将序列分为两大组。关键的是，分析揭示了与CMhm密切相关的序列实际上可能代表至少三个不同的遗传群体：一个与经典的CMhm（对应16S rDNA的A组，23S-ntST#1-3）一致；一个与之前研究中已描述的潜在新物种（对应16S rDNA的C组，23S-ntST#5,6）对应；以及本研究新发现的一个潜在新物种（对应16S rDNA的B组，23S-ntST#4）。遗传网络分析清晰地展示了这些群体之间显著的遗传距离。

关于CMt-like序列（16S-ntST#11; 23S-ntST#11），由于公共数据库中CMt的23S rDNA参考序列极为缺乏，其确切分类地位尚不明确，可能代表另一个潜在的新物种，但需要更多数据来确认。

配对一致性矩阵直观地展示了不同ntSTs之间以及它们与参考序列之间的百分比一致性，进一步支持了上述分组和新物种发现的结论。

研究结论与意义

本研究证实，在泰国的家猫中，血浆原体的感染较为普遍（17.5%）。更重要的是，通过整合16S和23S rRNA基因的分析，研究揭示了泰国猫群中至少存在五种血浆原体物种，包括Mhf、典型的CMhm、一个CMt-like物种，以及两个与CMhm密切相关的潜在新物种。这一发现显著增强了对猫血浆原体多样性的认识，表明此前基于单一16S rRNA基因的研究可能低估了其复杂性。

该研究的核心意义在于强调了使用多个独立遗传标记（如16S和23S rRNA基因）对于血浆原体物种准确鉴定和新物种发现的重要性。23S rRNA基因展现了比16S rRNA基因更强大的区分近缘物种的能力。研究结果提示，之前在不同国家和不同猫科动物（包括家猫和野生猫科动物）中仅凭16S rDNA被鉴定为CMhm的某些序列，实际上可能包含了尚未被描述的潜在新物种，这意味着CMhm谱系内的多样性可能具有全球性分布。

然而，研究者也谨慎地指出，仅凭两个遗传标记就确认一个新物种有时可能是不够充分的，因此他们使用了“潜在的（putative）”一词来描述这些新发现的遗传谱系。未来需要结合更多基因标记（如rnpB基因等）进行多基因位点序列分析（MLSA），以最终确认这些新物种的分类地位。

从临床角度看，精确的物种鉴定对于理解不同血浆原体病原的致病性、制定有效的治疗和防控策略至关重要。本研究发现的隐藏多样性对开发更精准的分子诊断方法提出了要求，例如能够区分这些潜在新物种的多重PCR检测。此外，血浆原体存在跨物种传播的可能性（例如，其他动物的血浆原体感染猫，或猫的血浆原体感染其他动物甚至人类），因此，全面了解其物种多样性对于公共卫生和野生动物保护也具有潜在意义。

总之，Thongmeesee等人的这项研究为泰国乃至全球猫血浆原体的研究提供了宝贵的分子流行病学数据，打开了CMhm谱系内隐藏的多样性宝库，为后续更深入的病原生物学、进化关系和临床影响研究奠定了坚实的基础。