蛋白酶激活受体2(PAR2)抗体抑制在多壁碳纳米管加剧过敏性肺病中的保护作用及机制研究

《Particle and Fibre Toxicology》：Inhibition of protease-activated receptor-2 attenuates multi-walled carbon nanotube exacerbation of allergic lung disease in mice

本研究针对多壁碳纳米管(MWCNTs)暴露加剧过敏性肺病的临床难题，通过PAR2特异性单克隆抗体SAM-11干预实验，发现抗体阻断可显著减轻MWCNTs与屋尘螨提取物(HDME)联合暴露诱导的小鼠气道胶原沉积、嗜酸性粒细胞浸润、黏液细胞化生及CD3+ T细胞浸润。该研究为PAR2靶向治疗过敏性气道疾病提供了新的实验依据。

　　

随着纳米技术的飞速发展，多壁碳纳米管(Multi-Walled Carbon Nanotubes, MWCNTs)作为一种重要的工程纳米材料，在电子、医药和材料科学等领域展现出广阔的应用前景。然而，其纳米级尺寸(10-100 nm)使得MWCNTs易于通过呼吸道深入肺部，对职业暴露人群和消费者的健康构成潜在威胁。研究表明，MWCNTs吸入可激活先天免疫细胞，引起肺部损伤和纤维化，甚至在哮喘动物模型中，与过敏原共同暴露会加剧肺部炎症和纤维化程度。

过敏性哮喘作为一种常见的慢性呼吸道疾病，其特征包括嗜酸性粒细胞炎症、气道黏液过度分泌和气道重塑。屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)是重要的室内过敏原，其提取物(House Dust Mite Extract, HDME)常被用于构建过敏性哮喘动物模型。在哮喘发病机制中，蛋白酶激活受体2(Protease-Activated Receptor 2, PAR2)作为一种G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor, GPCR)，在肺部高度表达，能够感知并响应细胞外蛋白水解环境的变化。PAR2被内源性丝氨酸蛋白酶(如类胰蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶)或过敏原中的蛋白酶激活后，可促进2型辅助T细胞(Type 2 Helper T Cell, Th2)优势微环境的形成，进而驱动白细胞介素4(Interleukin-4, IL-4)、IL-5和IL-13等细胞因子的产生，加剧哮喘特征性病理变化。

先前的研究发现，PAR2基因缺陷小鼠在MWCNTs和HDME联合暴露后，气道纤维化程度减轻，但嗜酸性粒细胞炎症和黏液细胞化生并未改善，这提示PAR2在过敏性肺病中可能通过复杂的信号网络发挥作用。然而，基因敲除模型可能因发育代偿或信号偏倚而无法完全模拟药物干预效果。因此，采用特异性单克隆抗体进行药理学干预，为精准解析PAR2在疾病中的功能提供了新的视角。

本研究旨在探讨PAR2单克隆抗体SAM-11能否抑制MWCNTs加剧的HDME诱导的过敏性肺病。研究人员通过为期21天的动物实验，采用口咽吸入法(Oropharyngeal Aspiration, OPA)给予C57BL/6J小鼠MWCNTs和HDME，并在每次暴露前注射SAM-11抗体。通过支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF)分析、肺组织病理学评估、分子生物学检测等技术手段，系统评价了SAM-11对过敏性炎症、气道重塑和纤维化的影响。

研究采用的主要技术方法包括：通过口咽吸入法建立小鼠MWCNTs和HDME联合暴露模型；使用单克隆抗体SAM-11进行PAR2信号通路干预；通过支气管肺泡灌洗液分析检测总蛋白、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)及细胞分类计数；采用实时定量聚合酶链反应(Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)检测肺组织中介质的mRNA表达；利用蛋白质免疫印迹(Western Blot)分析STAT6和Arg-1蛋白表达；通过组织化学染色(Masson三色染色和AB-PAS染色)及图像分析软件进行气道胶原和黏液定量；采用免疫组织化学方法检测CD3⁺ T细胞和CD20⁺ B细胞浸润。

SAM-11减轻MWCNTs和HDME诱导的过敏性肺部炎症

如图1所示，MWCNTs和HDME联合暴露显著升高了BALF中的总蛋白、LDH和总细胞数，而SAM-11预处理显著逆转了这些指标。细胞分类计数显示，联合暴露引起显著的嗜酸性粒细胞浸润，SAM-11处理后嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数量均显著减少，但对巨噬细胞数量无影响。同型对照抗体IgG2a则无此保护作用，表明SAM-11的作用具有特异性。

SAM-11缓解肺部纤维化和黏液过度分泌

组织病理学评分显示，SAM-11显著减轻了MWCNTs单独或与HDME联合暴露引起的肺部炎症。Masson三色染色显示，联合暴露组气道胶原沉积显著增加，而SAM-11处理使其恢复至对照组水平。AB-PAS染色结果表明，SAM-11显著抑制了联合暴露诱导的气道黏液分泌，而同型对照抗体无此效应。

SAM-11调控过敏性肺病关键基因表达

qRT-PCR分析显示，MWCNTs和HDME联合暴露显著上调了胶原蛋白1a1(Collagen Type I Alpha 1, Col1a1)、转化生长因子β1(Transforming Growth Factor Beta 1, Tgf-β1)、精氨酸酶1(Arginase-1, Arg-1)、黏液蛋白5b(Mucin 5B, Muc5b)和白细胞介素33(Interleukin-33, Il-33)的mRNA表达，而SAM-11处理显著抑制了这些基因的表达。值得注意的是，信号转导和转录激活因子6(Signal Transducer and Activator of Transcription 6, Stat6)的mRNA水平在各组间无显著变化。

SAM-11差异调节关键信号蛋白

Western blot结果显示，联合暴露显著增加了肺组织中磷酸化STAT6(p-STAT6)和Arg-1蛋白水平，而SAM-11显著降低了这两种蛋白的表达。酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)显示，虽然联合暴露组血清免疫球蛋白E(Immunoglobulin E, IgE)水平显著升高，但SAM-11处理对其无影响。BALF中嗜酸性粒细胞趋化因子CCL11(C-C Motif Chemokine Ligand 11)在MWCNTs暴露组升高，但不受SAM-11影响。

SAM-11减少T细胞而非B细胞肺部浸润

免疫组织化学分析显示，MWCNTs或HDME单独暴露均增加了CD3⁺ T细胞和CD20⁺ B细胞数量，而联合暴露引起最显著的增加。SAM-11显著降低了MWCNTs单独或与HDME联合暴露诱导的CD3⁺ T细胞数量，但对CD20⁺ B细胞无影响。

本研究通过药理学方法证实了PAR2在MWCNTs加剧过敏性肺病中的核心作用。与基因敲除模型相比，SAM-11抗体表现出更广泛的疗效，不仅减轻了气道纤维化，还显著抑制了嗜酸性粒细胞炎症和黏液细胞化生。这种差异可能源于抗体介导的PAR2阻断更有效地抑制了经典G蛋白信号通路，而基因缺失可能导致代偿性信号通路的激活。

研究结果揭示了PAR2抗体治疗通过多重机制发挥保护作用：抑制STAT6磷酸化从而干扰Th2细胞分化；减少Arg-1表达以限制胶原沉积；调控黏液相关基因Muc5b表达减轻气道黏液分泌。值得注意的是，SAM-11在不影响系统性IgE水平的情况下仍能缓解肺部病理变化，表明其作用主要针对局部组织反应而非全身免疫应答。

该研究为PAR2靶向治疗严重哮喘提供了实验依据，特别是针对环境颗粒物暴露加剧的过敏性气道疾病。未来研究需要进一步明确PAR2在不同细胞类型中的特异性功能，评估长期抗体治疗的安全性，并探索PAR2阻断对气道稳态的潜在影响。这些工作将推动PAR2靶向策略向临床应用迈进。