TOAST：基于68000个结核分枝杆菌基因组的新型靶向扩增子设计工具及其在耐药结核病高通量测序中的应用

《BMC Genomics》：TOAST: a novel tool for designing targeted gene amplicons and an optimised set of primers for high-throughput sequencing in tuberculosis genomic studies

本研究针对结核分枝杆菌(Mtb)耐药突变检测中传统扩增子测序(Amp-Seq)方法更新滞后、覆盖不全的问题，开发了TOAST(Tuberculosis Optimised Amplicon Sequencing Tool)软件。该工具通过整合68K临床分离株数据库，自动设计覆盖97%已知耐药突变的33个扩增子，经牛津纳米孔测序(ONT)验证显示所有靶点测序深度均超过50×，为耐药TB的快速诊断和基因组监测提供了高效、可定制的解决方案。

　　

结核病(TB)至今仍是全球重大公共卫生威胁，2023年数据显示新增感染病例达1080万，死亡病例130万。更严峻的是，耐药结核病的出现加剧了防控难度——全球约3.2%的新发结核病例和16%的经治病例对利福平(RR-TB)或利福平与异烟肼同时耐药(即耐多药结核病，MDR-TB)，其中6.2%进一步恶化为广泛耐药结核病(XDR-TB)，对氟喹诺酮类和至少一种A组抗结核药物(如贝达喹啉或利奈唑胺)耐药。

结核分枝杆菌(Mtb)的耐药性主要由药物靶点编码基因或药物活化相关酶的突变引起，包括单核苷酸多态性(SNP)、小片段插入缺失(indel)和大片段缺失。目前已在4.4 Mb的Mtb基因组中鉴定出92个与13种抗结核药物耐药相关的基因位点。虽然全基因组测序(WGS)在临床和流行病学研究中广泛应用，但基于扩增子测序(Amp-Seq)的靶向测序因其成本效益更高，更适用于资源有限地区的大规模样本筛查。

然而，现有扩增子设计工具存在明显局限：它们大多需要用户手动输入目标区域，无法自动适应快速演变的Mtb耐药突变图谱。随着新的耐药突变和菌株谱系多样性不断出现，扩增子检测方法需要频繁更新以确保覆盖范围和诊断效能。不同地区突变频率的差异进一步增加了个性化设计的需求。这些挑战催生了能够动态整合突变频率数据、自动优化引物设计的工具开发。

关键技术方法包括：基于68,395个Mtb临床分离株全基因组数据构建突变频率数据库；开发迭代突变搜索算法，根据突变频率优先选择扩增子靶点；采用Primer3进行引物设计，优化熔解温度(Tm)、GC含量等参数，并筛查二聚体形成和脱靶结合；通过牛津纳米孔技术(ONT)对葡萄牙和安哥拉的MDR临床菌株进行测序验证，评估覆盖均匀性和深度。

Amplicons and mutations covered

通过TOAST设计的33个扩增子（长度300-800 bp）覆盖了25个耐药相关基因中的2,230个已知突变，对68K数据库中的突变覆盖率达99.1%。关键基因如katG（异烟肼耐药）和rpoB（利福平耐药）分别设计了6个和1个扩增子，覆盖了92%和98%的已知耐药突变。仅pncA（吡嗪酰胺耐药）和tlyA（卷曲霉素耐药）覆盖度较低（分别为93.4%和63.3%），主要因低频突变较多且权重设计偏重高频突变。

Validation

ONT测序验证显示，葡萄牙和安哥拉MDR临床样本的测序数据中96.0%和94.8%的读长成功映射至目标区域。绝大多数扩增子测序深度超过500×，仅gid和ahpC基因的扩增子深度较低（最低55×），但仍高于50×的可靠性阈值。扩增子大小与测序深度呈负相关，但即使超过900 bp的扩增子也能维持50×以上覆盖度。

TOAST通过整合大规模临床基因组数据，实现了耐药突变驱动的自动化扩增子设计，解决了传统方法更新滞后、覆盖不全的痛点。其设计的33重扩增子面板对全球主要耐药突变覆盖率达97%以上，且通过ONT测序验证了其在临床样本中的鲁棒性。工具支持用户自定义突变数据库和引物参数，可灵活适配区域特异性突变谱系，为结核病及其他病原体的快速基因组监测提供了可扩展的技术框架。该研究发表于《BMC Genomics》，标志着靶向测序技术从静态设计向数据驱动动态优化的范式转变，对推进个性化耐药诊断具有重要价值。