新型双聚体FAP靶向双模态显像剂：优化肿瘤滞留实现精准手术导航的临床前研究

《European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging》：Novel dimeric dual-modality FAP-targeted agents with favorable tumor retention for image-guided surgery: a preclinical study

本研究针对头颈鳞癌等实体瘤手术切除不彻底的问题，开发了首例基于Fusarinine C支架的双聚体FAP靶向双模态（PET/荧光）显像剂，通过系统比较四种近红外荧光染料（s775z、IRDye800CW、ZW800、SulfoCy7）对探针性能的影响，发现s775z和IRDye800CW修饰的探针（67/68Ga-s775z-FFAPi与67Ga-IRDye-FFAPi）在临床前模型中表现出优异的肿瘤滞留（注射后1天>5% ID/g）和背景对比度，为术前核医学成像与术中荧光导航手术提供了新型工具。

　　

在头颈鳞癌（HNSCC）等实体瘤的手术治疗中，如何实现肿瘤的完整切除同时最大限度保留正常功能，一直是外科领域的重大挑战。由于肿瘤边界模糊和关键解剖结构毗邻，阳性手术切缘（PSM）发生率居高不下，直接导致术后复发风险显著升高。2024年美国国家综合癌症网络（NCCN）指南特别强调头颈癌手术中获取清晰切缘的重要性。在这一背景下，能够将术前精准定位与术中实时导航融为一体的创新技术方案，成为推动精准外科发展的关键突破口。

成纤维细胞活化蛋白（FAP）作为癌症相关成纤维细胞（CAF）中高度表达的特异性标志物，在超过90%的上皮源性肿瘤微环境中广泛存在，使其成为极具潜力的泛癌种靶点。相较于直接靶向肿瘤细胞，针对肿瘤基质中FAP的表达进行成像，更能全面反映肿瘤的真实浸润范围，特别是识别出传统影像难以发现的微小浸润灶。虽然基于FAP抑制剂（FAPI）的放射性示踪剂（如⁶⁸Ga-FAPI-46）已在诊断领域展现出优于¹⁸F-FDG的性能，但将其进一步开发为能够同时用于术前PET成像和术中荧光导航的双模态探针，仍面临诸多挑战。前期研究显示，简单地将荧光基团与FAPI结合往往会导致药代动力学特性恶化，影响肿瘤与本底的对比度。此外，理想的双模态探针需要单次注射后能在肿瘤部位快速富集并长时间滞留，以同时满足术前规划（通常注射后数小时）和术中导航（可能延迟至注射后24小时）的时间窗需求。研究表明，与单体相比，FAPI同型二聚体可通过多价效应增强与靶点的亲和力，并显著延长肿瘤内滞留时间，为开发新一代双模态探针提供了理想平台。

本研究创新性地将双聚体策略与双模态成像概念相结合，旨在开发一类新型FAP靶向探针。研究团队选用了天然铁载体Fusarinine C（FSC）作为多功能支架，其优势在于能高效螯合⁶⁸Ga（用于PET）和⁸⁹Zr（用于长半衰期PET），并可方便地连接多个功能单元。他们在该支架上引入了两个FAP靶向单元，并通过聚乙二醇（PEG）连接器增强水溶性。研究的核心创新点在于系统性地比较了四种结构各异的近红外七甲川花菁染料（Cy7）——SulfoCy7、FDA批准的IRDye800CW、以及两性离子染料ZW800和s775z——对最终双模态探针的理化性质、靶向能力和体内分布的影响。其中，s775z染料因其独特的化学结构（带有额外的空间屏蔽臂）而具有优异的光稳定性和化学稳定性，且其与FAP靶向小分子的结合属首次报道。

为开展研究，研究人员主要应用了几项关键技术方法：在化学合成方面，采用固相合成与点击化学结合的策略，构建了基于FSC支架的双聚体探针前体；在体外评价中，利用稳定转染人FAP的HT1080hFAP细胞模型，通过放射性细胞结合/内化实验、竞争性结合试验（测定IC₅₀）和荧光显微镜评估探针的靶向特异性和细胞内化行为；在体内评价中，使用荷HT1080hFAP/HT1080肿瘤的BALB/c裸鼠模型，通过离体生物分布实验、小动物PET/CT、SPECT/CT和近红外荧光成像（NIRF），全面评估了探针的药代动力学、肿瘤靶向性、滞留特性和多模态成像能力。

结果

探针的合成、标记与体外表征

成功合成了四种双模态探针（s775z-FFAPi, IRDye-FFAPi, ZW800-FFAPi, SCy7-FFAPi）及无荧光团的对照探针（Ac-FFAPi）。所有探针均能高效与⁶⁸Ga（室温，10分钟）、⁶⁷Ga（80°C，10分钟）和⁸⁹Zr（40°C，30分钟）络合，放射化学产率和纯度均较高。理化性质分析表明，⁶⁸Ga标记的s775z-FFAPi具有最高的亲水性（LogD_pH7.4 = -2.92），且其亲水性显著高于无荧光团的对照探针，体现了s775z染料对改善探针理化性质的积极贡献。所有探针在人血清中均表现出高稳定性（4小时内放射性核素释放<4%）。

体外靶向性与细胞滞留

放射性细胞结合实验显示，所有双模态探针在HT1080hFAP细胞中均表现出特异性摄取，其中⁶⁸Ga-ZW800-FFAPi和⁶⁸Ga-s775z-FFAPi的内化率最高（分别为25.7±1.1%和28.0±2.5%），且显著高于对照探针（18.9±2.5%）。⁸⁹Zr标记的s775z-FFAPi也表现出类似的高内化率。荧光显微镜观察证实，所有非标记双模态探针均能通过FAP介导进入HT1080hFAP细胞胞浆。竞争结合试验测得[natGa]Ga-s775z-FFAPi和[natGa]Ga-IRDye-FFAPi的IC₅₀值分别为3.7 nM和3.9 nM，与参考化合物[natGa]Ga-FAPI-46（2.2 nM）处于同一纳摩尔水平。细胞滞留实验表明，双模态探针和对照探针在2小时内能保留超过95%的内化活性，且在与过量FAPI-46共孵育（阻断重新结合）的条件下，也未出现明显的洗脱，表明其具有优异的细胞内滞留特性，这与临床常用的[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46形成鲜明对比。

健康小鼠体内的生物分布

在健康小鼠中进行的头对头生物分布研究（注射后1小时）清晰揭示了不同荧光团对探针体内行为的显著影响。[⁶⁸Ga]Ga-SCy7-FFAPi在肝脏、脾脏出现异常高摄取，提示可能形成聚集体。[⁶⁸Ga]Ga-s775z-FFAPi表现出最理想的分布谱，其在肝脏的累积显著低于[⁶⁸Ga]Ga-ZW800-FFAPi（2.20±0.03 %ID/g vs 5.10±0.16 %ID/g），在肾脏的累积显著低于[⁶⁸Ga]Ga-IRDye-FFAPi（3.78±0.32 %ID/g vs 6.75±0.64 %ID/g）。尤为重要的是，与无荧光团的[⁶⁸Ga]Ga-Ac-FFAPi对照相比，[⁶⁸Ga]Ga-s775z-FFAPi在血液、脾脏、胰腺、胃、肠道、肝脏、心脏等多个非靶器官的累积均显著降低，表明s775z的引入整体改善了探针的药代动力学 profile。[⁶⁸Ga]Ga-IRDye-FFAPi也显示出比对照探针更优的分布特性，但其肾脏摄取较高是其特点。

荷瘤小鼠模型的成像与生物分布评价

在荷HT1080hFAP/HT1080肿瘤的小鼠模型中，[⁶⁷Ga]Ga-s775z-FFAPi和[⁶⁷Ga]Ga-IRDye-FFAPi在注射后1小时表现出强劲的肿瘤摄取（分别7.57±1.06 %ID/g和7.04±0.91 %ID/g），并且具有良好的肿瘤滞留能力，至注射后1天，肿瘤摄取仍分别保持在5.44±0.23 %ID/g和7.48±0.79 %ID/g。[⁶⁷Ga]Ga-ZW800-FFAPi的肿瘤滞留也较好（1天时4.51±0.49 %ID/g），但其肝脏本底较高。PET/CT成像显示，[⁶⁸Ga]Ga-s775z-FFAPi在早期时间点的图像质量与临床已应用的[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46相当。SPECT/CT和近红外荧光成像的动态监测进一步证实，[⁶⁷Ga]Ga-s775z-FFAPi和[⁶⁷Ga]Ga-IRDye-FFAPi单次注射后，能在长达1天（SPECT和荧光）甚至2天（仅荧光）的时间内清晰显示肿瘤病灶，证明了其用于术前计划（PET/SPECT）和术中导航（荧光）的可行性。

结论与讨论

本研究成功设计并评价了首例双聚体FAP靶向双模态成像剂。研究系统地揭示了不同荧光团对探针性能的深刻影响，超越了简单的“标签”作用。其中，s775z染料的引入展现出多重益处：不仅提升了探针的亲水性和细胞摄取，还优化了其体内分布，显著降低了关键非靶器官（如肝、肾）的本底摄取，从而获得了更优的靶向信噪比。IRDye800CW修饰的探针虽然在肾脏摄取较高，但在后期时间点表现出卓越的肿瘤滞留和对比度。

这项研究的意义在于，它证实了通过精心的分子设计（如采用双聚体策略和筛选最优荧光团），能够开发出药代动力学特性优良的双模态探针。[^67/68Ga]Ga-s775z-FFAPi和[⁶⁷Ga]Ga-IRDye-FFAPi在临床前模型中表现出的持久肿瘤滞留和高对比度，使其成为实现“单次注射、多时间点成像”（从术前核素成像到术中荧光导航）的理想候选者，为推进头颈癌及其他FAP阳性肿瘤的精准手术带来了新希望。未来研究需要在使用更具临床相关性FAP表达模型（如原代CAFs）以及真实手术场景下进一步验证这些探针的应用潜力。本研究发表于《European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging》，为FAP靶向诊疗领域的发展提供了重要的工具和思路。