RASSF1A/TSPYL5甲基化联合AFP蛋白作为肝细胞癌血浆生物标志物的整合研究

《Journal of Cancer Research and Clinical Oncology》：Integration of RASSF1A and TSPYL5 methylation and AFP protein as plasma biomarker for hepatocellular carcinoma diagnosis

本研究针对肝细胞癌(HCC)早期诊断缺乏有效生物标志物的临床难题，通过整合RASSF1A和TSPYL5基因甲基化检测与AFP蛋白分析，开发了ARTHCC诊断模型。该模型在训练集和验证集中均展现出优异的诊断性能（AUC达0.917），对早期HCC的检测灵敏度显著优于传统AFP检测（81.8% vs 36.4%），为HCC的液体活检提供了新的高效解决方案。

　　

在全球癌症统计中，肝细胞癌(HCC)位列全球第六大常见癌症，同时是癌症相关死亡的第三大原因。尽管近年来HCC的诊断和治疗取得了显著进展，但中国HCC患者的五年生存率仍处于较低水平。临床实践表明，接受根治性治疗的早期HCC患者五年生存率可显著提高，然而目前约70%-80%的患者确诊时已处于中晚期，错过了最佳治疗时机。

这一严峻现状的背后，是HCC筛查面临的诸多挑战。当前美国肝病研究学会(AASLD)指南推荐的腹部超声(US)联合甲胎蛋白(AFP)筛查方案，对早期HCC的检测灵敏度仅为63%，且超声检查效果易受操作者经验和患者特征（如肥胖）的影响。虽然CT和MRI具有更高的诊断敏感性，但需要注射对比剂可能引发过敏反应和肾毒性，同时高昂的费用和就医不便也限制了其在筛查中的应用。

在这一背景下，液体活检技术为HCC早期诊断带来了新的希望。循环肿瘤DNA(ctDNA)不仅携带肿瘤特异性基因突变，还包含独特的表观遗传标记，特别是DNA甲基化。在肿瘤发生的最早期阶段即可出现异常甲基化改变，而HCC正是一种高频、多基因CpG岛甲基化的恶性肿瘤。肿瘤抑制基因启动子CpG岛高甲基化介导的表观遗传沉默是HCC发展过程中的关键分子事件。

在此研究背景下，研究人员将目光投向了两个重要的肿瘤相关基因：RASSF1A和TSPYL5。RASSF1A是人类癌症中最常发生表观遗传失活的肿瘤抑制基因之一，其在HCC的发生发展中起着重要作用。值得注意的是，HCC患者外周血中甲基化RASSF1A的频率(40%)显著高于肝硬化患者(14%)和普通人群(0%)。TSPYL5是TSPY样蛋白家族成员，通过与肿瘤抑制因子p53的去泛素化酶USP7相互作用，调节p53蛋白水平。最近研究发现，TSPYL5是人类肝细胞癌变的表观遗传"守门人"，在HCC转化过程中表现出从肝硬化组织到不典型增生结节再到小HCC的逐步启动子高甲基化。

近年来，血清蛋白标志物与甲基化标志物的联合应用显示出巨大的HCC筛查潜力。多项研究表明，包含AFP、性别和三个甲基化标志物的多靶点panel对早期HCC的检测灵敏度优于单独使用AFP或GALAD评分。同样，血清RASSF1A甲基化与AFP联合检测在区分乙型肝炎病毒(HBV)相关HCC与慢性乙型肝炎患者时，其曲线下面积(AUC)达到0.876，优于单独使用RASSF1A甲基化(AUC:0.796)或AFP(AUC:0.756)。

本研究旨在开发一种新型的血清甲基化与蛋白生物标志物组合panel用于HCC筛查，并验证其在HCC诊断中的性能。研究人员通过生物信息学分析、细胞系验证和临床血浆样本检测，系统评估了RASSF1A和TSPYL5甲基化作为HCC诊断生物标志物的潜力，并建立了整合年龄、性别、基因甲基化和AFP的ARTHCC诊断模型。

研究采用的主要技术方法包括：利用MethSurv、LinkedOmics和Wanderer数据库进行生物信息学分析；通过定量甲基化特异性PCR(qMSP)检测基因甲基化水平；使用逻辑回归算法构建ARTHCC诊断模型。研究纳来自两家医院的398名参与者，包括发现队列（211例）和独立外部验证队列（99例），所有样本均经过严格的质控标准。

RASSF1A和TSPYL5甲基化在HCC中的特征

通过Methsurv对TCGA肝癌队列(LIHC)的全面分析显示，TSPYL5的大多数CpG位点在HCC组织样本中呈现高甲基化，特别是在CpG岛(CGI)和北CpG岸区域。相比之下，RASSF1A仅有约40%的CpG位点显示高甲基化。RASSF1A的高甲基化位点主要位于基因体和3'-UTR区域，而TSPYL5的甲基化位点主要分布在第一外显子。

LinkedOmics功能模块的mRNA测序数据分析表明，1781个基因与RASSF1A高甲基化呈显著正相关，2206个基因呈显著负相关。而1816个基因与TSPYL5高甲基化呈显著正相关，5890个基因呈显著负相关。基因本体(GO)功能富集分析显示，与RASSF1A高甲基化相关的差异表达基因主要参与胶原三聚体和细胞外基质组成，功能涉及对血管内皮生长因子刺激的细胞反应、血管生成和动脉发育。KEGG通路富集表明这些基因主要集中在钙信号通路和脂肪细胞脂解调节。而与TSPYL5高甲基化相关的基因主要位于内质网质量控制区室，功能涉及过氧化物酶体转运和rRNA结合，影响核苷酸切除修复和DNA复制。

甲基化水平的实验验证

研究人员筛选了HCC特异性的RASSF1A和TSPYL5甲基化区域，通过Wanderer分析TCGA-LIHC和相应正常组织样本中特定区域的DNA甲基化状态。发现在选定区域内，肿瘤组织(n=256)与非肿瘤组织(n=50)样本之间的甲基化水平存在显著差异。

在HCC细胞系和临床HCC血浆样本中进一步评估了两个区域的甲基化水平。qMSP检测结果显示，HCC细胞系中两个区域的甲基化水平显著高于正常白细胞对照组。在甲基化水平验证队列（88例，包括43例HCC和45例CHB患者）的血浆样本中观察到类似结果，证实了这两个基因在HCC中的高甲基化特征。

ARTHCC诊断模型的建立与验证

研究人员构建了基于逻辑回归算法的ARTHCC HCC检测模型，整合了患者年龄、性别、基因甲基化(TSPYL5、RASSF1A)和AFP蛋白数据。发现队列按癌症分期、年龄和性别以1:1比例分为训练集和内部验证集。

训练集包含38例HCC和69例肝病对照。HCC病例中男性占89.5%，早期病变占32.4%。对于整体和早期HCC检测，ARTHCC的AUC值分别为0.917和0.802，优于单个标志物的表现。在训练集和内部验证集中，HCC患者的预测概率显著高于非HCC肝病患者，且预测概率随肿瘤分期增加而升高。

在训练集中，ARTHCC表现出86.8%的整体敏感度和69.2%的早期敏感度，特异性为85.5%。在内部验证集（34例HCC和70例肝病对照）中，ARTHCC对整体HCC检测的AUC为0.900，而AFP的AUC为0.740。对于早期HCC检测，ARTHCC的AUC为0.834，AFP为0.583。ARTHCC在内部验证集中表现出85.3%的整体敏感度和81.8%的早期敏感度，特异性为92.9%。

亚组分析显示，ARTHCC模型在性别、Child-Pugh分级（A级vs B级）、病毒状态、肝硬化状态和AFP阴性受试者等关键亚组中均保持稳定性能。特别是在AFP阴性人群(AFP<20 ng/mL)中，敏感度为66.7%，特异性为96.4%。

独立外部验证

在包含19例HCC和80例肝硬化对照的独立外部验证数据集中，ARTHCC对整体HCC检测的AUC为0.922，AFP为0.782。HCC患者的预测概率随肿瘤分期增加而升高，且显著高于良性疾病对照组。在独立验证集中，ARTHCC表现出84.2%的整体敏感度和81.8%的早期敏感度，特异性为90.0%。

甲基化状态与肝功能参数的相关性

为确定AFP是否是与TSPYL5和RASSF1A高甲基化状态唯一相关的诊断蛋白，研究人员对72例HCC患者的RASSF1A甲基化状态、TSPYL5甲基化状态和肝功能相关参数进行了正态性检验。RASSF1A甲基化状态与白蛋白(ALB)呈正态分布，而其他参数不符合正态分布。

RASSF1A甲基化状态与总胆红素(TBIL)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和AFP呈强负相关(P<0.05)，其中与AFP的相关性最为显著(p≈-0.498，P<0.0001)。TSPYL5与ALB呈弱正相关，与TBIL、AST和AFP呈强负相关(P<0.05)，其中与AFP的相关性最强(p≈-0.570，P<0.0001)。

门静脉癌栓(PVTT)与基因甲基化的关系

在发现队列中探讨了RASSF1A/TSPYL5甲基化与HCC患者PVTT的关系。有趣的是，发现TSPYL5甲基化状态与PVTT存在显著相关性(P=0.006)，有PVTT的患者TSPYL5甲基化水平显著高于无PVTT的患者。这一发现为PVTT形成的表观遗传机制提供了新的线索。

本研究通过文献挖掘和生物信息学网络分析，证实了RASSF1A和TSPYL5甲基化参与HCC的发生。整合评估RASSF1A和TSPYL5甲基化以及AFP蛋白在血浆样本中的表现，显示出对HCC检测的高效性。ARTHCC模型在发现队列和验证队列中均表现出卓越的诊断性能，特别是在早期HCC检测方面显著优于传统的AFP检测。

研究的创新之处在于首次将RASSF1A和TSPYL5甲基化与AFP蛋白整合构建诊断模型，并进行了系统的内部和外部验证。研究发现TSPYL5甲基化与PVTT的相关性为HCC转移机制研究提供了新的方向。此外，研究证实了甲基化标志物与肝功能参数特别是AFP的相关性，为理解表观遗传改变与临床指标的关系提供了依据。

然而，研究也存在一定局限性。研究方法局限于文献挖掘和公共数据集的生物信息学分析，缺乏对这些高甲基化标志物在HCC发展中潜在生物学功能的实验验证。此外，相对较小的样本量可能影响研究结果的稳健性。未来需要大规模多中心前瞻性随机对照临床试验来验证ARTHCC模型的临床性能。

总体而言，这项研究为HCC的早期诊断提供了有前景的新型非侵入性生物标志物组合。利用血浆中RASSF1A和TSPYL5甲基化作为HCC早期筛查的新型非侵入性生物标志物是可行的，ARTHCC模型的应用有望改善HCC患者的早期诊断率和生存预后。