REST转录因子通过调控SOX2表达及MAPK/WNT通路在hiPSC衍生神经元模型中主导人类神经发生

《Metabolic Brain Disease》：Pharmacological inhibition of RE1 silencing transcription factor disrupts SOX2 expression and neurogenesis in human induced pluripotent stem cells derived neuronal models

本研究针对RE1沉默转录因子(REST)在人类神经发生过程中的调控机制这一空白，利用人诱导多能干细胞(hiPSC)衍生神经元模型，探讨了REST的表达模式及其功能。研究人员发现，药理抑制REST会破坏SOX2表达及MAPK/WNT信号轴，进而损害神经干细胞(NSC)增殖与分化。该研究揭示了REST在人类神经发育中的核心作用，为神经发育疾病治疗提供了新靶点。

　　

大脑如何从一群简单的干细胞发育成高度复杂的器官，是生命科学领域最迷人的谜题之一。在这一精密的过程中，转录因子扮演着“总指挥”的角色，它们通过开启或关闭特定基因，精确引导着细胞分化的命运走向。其中，RE1沉默转录因子(REST)，也称为神经元限制性沉默因子(NRSF)，是一个关键的调控因子。传统观点认为，REST主要作为抑制因子，在非神经元细胞中抑制神经元特异性基因的表达，从而防止它们错误地分化为神经元。然而，近年来在一些动物模型中的研究发现，REST的功能远比想象中复杂，它并非简单的“开关”，其表达水平和细胞内定位的动态变化，对于神经发生的正常进行至关重要。

然而，一个巨大的挑战在于，大多数关于REST功能的研究都基于小鼠等模式生物。越来越多的证据表明，人类和小鼠的REST所调控的基因网络存在显著差异。例如，在人类胚胎干细胞中发现的REST结合位点数量是小鼠的两倍。这意味着，直接将从小鼠研究中获得的结论外推至人类，可能存在风险。REST在人类神经发生过程中的具体表达模式、调控靶点以及其功能，仍然是一个未被充分探索的领域。理解REST在人类自身神经发育中的精确作用，对于揭示神经发育障碍的病因和开发新的治疗策略具有重大意义。

为了直接回答“REST如何调控人类神经发生”这一核心问题，一项发表在《Metabolic Brain Disease》上的研究巧妙地利用了人诱导多能干细胞(hiPSC)技术。hiPSC可以被诱导分化为任何类型的人类细胞，包括神经干细胞和成熟的神经元，从而在培养皿中“重演”人类大脑的早期发育过程。研究人员通过这一模型，系统地描绘了REST在神经发生不同阶段的表达图谱，并采用一种名为X5050的特异性REST抑制剂，深入探究了抑制REST功能对神经发生的连锁影响。

为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键技术方法：首先，他们建立并培养了人诱导多能干细胞(hiPSC)，并将其定向诱导分化为神经干细胞(NSC)和成熟神经元，作为研究人类神经发生的模型。其次，他们利用免疫细胞化学技术对hiPSC的多能性标志物(如SOX2、OCT4)和神经元的标志物(如TUJ-1)进行染色和鉴定，并通过定量PCR(qPCR)在mRNA水平上进行验证。第三，他们使用Western blotting和免疫荧光技术，检测了REST及其关键靶点SOX2在不同发育阶段和经过X5050处理后的蛋白表达水平与细胞内的定位变化。最后，他们对经X5050处理的神经干细胞进行了蛋白质组学分析，以无偏倚的方式大规模筛选受REST抑制影响的蛋白质和信号通路。

研究结果

分子验证hiPSC和hiPSC衍生神经元

研究首先证实了实验模型的可靠性。免疫荧光染色显示，hiPSCs高表达多能性标志物SOX2和OCT4，且定位于细胞核。qPCR分析进一步表明，与不表达这些标志物的人胚胎肾293(HEK293)细胞相比，hiPSCs中OCT4和Nanog的mRNA水平显著更高。成功诱导分化后，衍生神经元表现出强烈的早期神经元标志物TUJ-1（βIII-微管蛋白）阳性信号，qPCR也证实神经元中TUJ-1的mRNA水平远高于未分化的hiPSCs。这些结果共同验证了所用hiPSCs的多能性及其高效分化为神经元的能力。

hiPSCs及其衍生的未成熟和成熟神经元中均存在REST表达

通过免疫荧光技术追踪REST蛋白的踪迹，研究人员发现REST在神经发生的各个阶段持续存在，但其在细胞内的“居住地”却发生了有趣的变化。在hiPSCs中，REST主要“游荡”在细胞质中。而当细胞分化为未成熟神经元时，REST开始向细胞核“集结”，同时也在轴突中有所分布。到了成熟神经元阶段，REST则几乎完全“定居”于细胞核内，并从轴突中“撤离”。这一动态的定位变化提示，REST的功能可能与其在细胞内的位置密切相关，为理解其在不同发育阶段的差异化调控作用提供了线索。

X5050以时间依赖性方式降低REST蛋白水平

为了探究REST的功能，研究使用了小分子抑制剂X5050。Western blotting结果显示，在hiPSCs中，50μM和100μM的X5050处理24小时均能有效降低REST蛋白水平。然而，在100μM浓度下处理48和72小时后，REST蛋白水平却出现了回升。这表明X5050对REST的降解作用是时间依赖性的，其抑制作用可能持续约24小时。类似的REST水平下降也在用X5050处理不同天数的神经干细胞(NSC)和神经前体细胞(NPC)中观察到，证实了X5050在不同发育阶段抑制REST的有效性。

REST缺陷NSC的蛋白质组学分析

为了全面评估REST缺失对神经干细胞的全局性影响，研究人员对经X5050处理和未处理的NSC进行了蛋白质组学分析。结果显示，REST抑制导致了蛋白质表达的广泛重塑。在919个发生显著变化的蛋白质中，高达80%是下调的。基因本体论分析指出，受影响最显著的是与神经发生和干细胞增殖相关的蛋白质。具体而言，92个参与神经发生的蛋白质被下调，其中包括许多对神经分化、轴突发育和树突发育至关重要的因子。尤为引人注目的是，一些关键的正向调控神经发生的蛋白，如Lin28a、SOX2、NESTIN和CTBP2，其表达均显著降低。与此同时，一些负向调控神经发生的蛋白，如BAG5、PSEN1等，则出现上调。在干细胞增殖方面，包括MKI67（增殖标志物Ki-67）、YAP1、CTNNB1（β-连环蛋白）在内的多个促进增殖的基因被抑制，而HNRNPU、HMGB2等少数基因则上调。此外，蛋白质组学数据还揭示了REST抑制对两条关键信号通路的深刻影响：MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路中的MAPK3、MAP2K1等关键分子被下调；WNT信号通路中的核心组分CTNNB1、CTBP2等也显著减少。这些发现表明，REST是维持神经干细胞状态和驱动神经发生所必需的分子网络的核心调控者。

蛋白质组学发现的验证和支持

蛋白质组学筛选出的最关键的差异表达蛋白之一是SOX2，它是维持神经干细胞特性不可或缺的转录因子。Western blotting验证证实，无论在分化早期（NSC阶段）还是晚期（NPC阶段），用X5050抑制REST均会导致SOX2蛋白水平的显著下降。这强烈提示REST与SOX2之间存在功能上的关联，REST是维持正常SOX2表达所必需的。为了进一步佐证蛋白质组学结果，研究人员进行了qPCR分析，发现REST抑制后，NESTIN、CTNNB1（β-连环蛋白基因）和MAPK3的mRNA水平也一致性地下调。这虽然在蛋白质水平上仍需最终确认，但在转录层面为REST调控这些关键分子提供了支持性证据。

结论与意义

这项研究系统地阐明了REST在人类神经发生过程中的核心作用。研究发现，REST在从hiPSC到成熟神经元的整个发育谱系中持续表达，但其亚细胞定位呈现动态变化。通过药理学家X5050抑制REST功能，会破坏神经发生的进程。其分子机制在于，REST的缺失导致关键神经发生调控因子SOX2的表达显著下调，并扰动了MAPK和WNT这两条对神经发育至关重要的信号通路。蛋白质组学分析进一步揭示了REST调控着一个广泛的基因网络，影响干细胞增殖、分化和多个信号转导过程。

该研究的重大意义在于，它首次在真正的人类细胞模型中详细揭示了REST在神经发生中的正面调控作用，挑战了其仅作为抑制因子的简单观点。研究表明，REST的功能如同一个“主控开关”，需要在其同时间以正确的强度被激活，才能确保神经发生的精确进行。过早或过强的抑制反而会破坏这一精密过程。这些发现不仅深化了我们对人类大脑发育基本规律的理解，更重要的是，为诸如自闭症、智力障碍等神经发育障碍的病因学研究提供了新视角。由于REST活性异常与多种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）也密切相关，本研究也为针对REST通路开发新的干预策略奠定了坚实的理论基础。未来，调控REST活性或许有望成为治疗一系列神经系统疾病的新途径。