揭示脯氨酰内肽酶作为口蹄疫病毒感染关键宿主因子的多重功能机制

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Prolyl endopeptidase is a multifunctional host factor required for FMDV infection

本研究针对口蹄疫病毒(FMDV)感染机制不清的问题，通过CRISPR/Cas9筛选发现脯氨酰内肽酶(PREP)是FMDV感染的关键宿主因子。研究人员证实PREP敲除通过蛋白酶体和凋亡途径 destabilizes PUM1蛋白，增强RIG-I启动子活性，上调RIG-I和MDA5表达，激活I型干扰素(IFN)信号通路；同时抑制FMDV复制阶段生命周期。体内实验表明PREP抑制剂黄芩素(baicalein)和基因敲除均能有效抵抗FMDV感染。该研究为抗病毒药物研发和抗病育种提供了新靶点。

　　

口蹄疫作为全球范围内对畜牧业生产构成重大威胁的病毒性传染病，其病原体口蹄疫病毒(FMDV)具有高度传染性，能够感染猪、牛、羊等70多种动物。世界动物卫生组织(WOAH)将其列为必须通报的动物疾病，因为其暴发会造成严重的经济损失。FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，是一种单股正链RNA病毒，其基因组编码一个多聚蛋白，经病毒蛋白酶加工产生4种结构蛋白(VP1-VP4)和8种非结构蛋白。该病毒存在7种血清型(O、A、C、Asia 1以及SAT1-3)，遗传多样性显著，给有效疫苗和抗病毒策略的开发带来巨大挑战。

尽管对FMDV的分子机制已有相当了解，但关于宿主遗传因素如何影响对FMDV感染易感性和抵抗力的知识仍存在显著空白。病毒利用宿主因子促进复制的过程是潜在的治疗靶点。例如，组蛋白去乙酰化酶8(HDAC8)和TOB1等宿主因子已被发现通过调节I型干扰素(IFN)信号通路或病毒进入过程影响FMDV感染。深入理解FMDV与宿主相互作用对于识别新型抗病毒靶点和推进抗病动物育种策略至关重要。

在这项发表于《Cellular and Molecular Life Sciences》的研究中，研究人员通过全基因组CRISPR筛选技术，发现脯氨酰内肽酶(PREP，也称为脯氨酰寡肽酶POP)是FMDV感染的关键宿主因子。PREP是一种S9家族的丝氨酸蛋白酶，以往研究主要聚焦于其在神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化中的作用，而其在病毒感染中的功能尚未被探索。

为了回答PREP如何影响FMDV感染这一科学问题，研究团队运用了多种关键技术方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PREP敲除(PREP-KO)的IBRS-2和PK-15细胞系；通过转录组测序(RNA-seq)分析差异表达基因(DEGs)并进行GO和KEGG通路富集分析；采用蛋白质免疫印迹(Western blot)、免疫荧光(IFA)和共聚焦显微镜技术检测蛋白表达和定位；通过病毒空斑试验和TCID₅₀测定评估病毒滴度；利用双荧光素酶报告基因系统分析RIG-I启动子和FMDV内部核糖体进入位点(IRES)活性；通过免疫共沉淀(Co-IP)验证蛋白相互作用；使用蛋白酶体抑制剂MG132、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK等探讨蛋白降解途径；并建立了小鼠FMDV感染模型评估PREP抑制剂黄芩素和PREP基因敲除的体内抗病毒效果。实验所用细胞系包括IBRS-2、PK-15、iPAM和HEK293T，小鼠样本来自兰州兽医研究所和上海模式生物中心。

PREP-KO显著抑制FMDV感染

研究人员首先通过CRISPR/Cas9技术构建了PREP-KO的IBRS-2细胞系。Sanger测序证实三个PREP-KO细胞系均存在核苷酸插入或缺失，导致PREP编码区移码突变。蛋白质免疫印迹分析进一步验证了这些细胞中PREP蛋白表达的完全缺失。当以0.01感染复数(MOI)的FMDV攻击时，所有PREP-KO细胞均表现出对FMDV诱导的细胞病变效应(CPE)的强大抵抗力，CPE出现时间较sgNC对照组延迟。无论接种低滴度(MOI=0.01)还是高滴度(MOI=1)病毒，PREP-KO细胞中均检测不到FMDV结构蛋白VP1。病毒空斑试验和间接免疫荧光分析进一步证实了这一结果。病毒滴度分析显示，在MOI=1感染后6小时，PREP-KO细胞中的FMDV滴度显著降低，其中PREP-KO2细胞降低幅度最大(近2.70 log TCID₅₀/0.1 mL)。在PREP-KO的PK-15细胞中也观察到类似现象，病毒感染延迟约12小时，病毒滴度较对照组低近4 log TCID₅₀/0.1 mL。更重要的是，在PREP-KO细胞中恢复PREP表达后，FMDV VP1蛋白表达和病毒感染性均得以恢复，证实了PREP敲除的功能特异性。相反，在IBRS-2细胞中过表达GFP-PREP或PREP-GFP后，FMDV感染显著增强。这些结果表明PREP是FMDV感染的关键宿主因子，并参与病毒生命周期。

I型IFN信号通路在PREP-KO IBRS-2细胞中显著激活

为探究PREP-KO细胞抵抗FMDV感染的分子机制，研究人员对未感染的PREP-KO和sgNC对照细胞进行了转录组测序。差异表达分析鉴定出2,160个差异表达基因(DEGs)，其中949个上调，1,211个下调。GO分析显示这些DEGs富集于病毒防御反应、I型IFN信号通路、先天免疫反应和病毒基因组复制负调控等生物过程。KEGG通路分析识别出多个病毒感染相关通路，以及RIG-I样受体和JAK-STAT信号通路。对前50个上调基因的分析显示IFN和IFN刺激基因(ISGs)显著诱导，其中OASL mRNA水平增加近5,000倍，IFN-β1 mRNA增加约700倍。RT-qPCR验证了这些趋势，与RNA-seq结果高度一致。挽救实验表明，在PREP-KO细胞中重新引入PREP可部分降低IFN和ISGs的表达。用猪IFN-β抗体处理可显著下调PREP-KO细胞中ISGs的表达，证实了I型IFN通路的参与。有趣的是，在PK-15和HEK293T细胞中进行PREP-KO并未观察到IFN或ISGs的上调，表明PREP对I型IFN信号通路的调节具有细胞特异性。

PREP-KO IBRS-2细胞通过降低PUM1稳定性上调RIG-I mRNA表达

为阐明PREP-KO细胞中IFN-β和ISGs上调的分子机制，研究人员检测了I型IFN信号通路中的关键适配分子。蛋白质免疫印迹显示，三个PREP-KO细胞中RIG-I、IRF3、IkBα和p65蛋白水平均高于sgNC对照细胞。相反，稳定表达GFP-PREP的IBRS-2细胞中RIG-I表达降低，提示PREP通过调节适配分子(特别是RIG-I)负调控I型IFN信号通路。RT-qPCR进一步显示PREP-KO细胞中RIG-I和MDA5 mRNA水平显著上调，而MAVS mRNA无变化。由于mRNA稳定性是影响mRNA水平的关键因素，研究人员探讨了其是否参与RIG-I mRNA上调，结果发现PREP-KO细胞中RIG-I mRNA稳定性反而显著降低，表明RIG-I mRNA水平升高并非稳定性增加所致。

先前研究表明RNA结合蛋白PUM1可调节RIG-I和MDA5 mRNA表达。与此一致，转录组分析显示PREP-KO细胞中PUM1 mRNA水平降低。RT-qPCR和蛋白质免疫印迹验证了PUM1 mRNA和蛋白水平的显著下降。为评估PUM1表达降低的功能影响，研究人员用PUM1 siRNA处理IBRS-2细胞，发现PUM1敲低可显著增加IFN和ISGs的表达，与PREP-KO细胞中的变化一致。这些发现表明PUM1表达降低增强了IBRS-2细胞中IFN和ISGs的水平。

为探究PREP与PUM1的关系，研究人员在HEK293T细胞中进行了免疫共沉淀实验，证实了PREP与PUM1之间存在直接相互作用。放线菌酮(CHX)追踪实验表明，缺乏PREP时PUM1蛋白稳定性显著降低。为确定涉及的降解途径，研究人员用针对蛋白酶体(MG132)、溶酶体(氯喹CQ)和半胱天冬酶(Z-VAD-FMK)的抑制剂处理细胞，发现MG132和Z-VAD-FMK均能恢复PUM1蛋白水平，表明PREP通过蛋白酶体和凋亡途径维持PUM1稳定性。进一步的半胱天冬酶特异性抑制剂分析显示，caspase 3、7和8参与PUM1降解。最后，研究人员利用含有2,200 bp猪RIG-I启动子的双荧光素酶报告系统检测了PUM1在RIG-I表达中的作用，发现PUM1沉默显著增强RIG-I启动子活性。这些发现表明PREP-KO通过 destabilizes PUM1，进而通过转录激活上调RIG-I mRNA，从而激活I型IFN信号通路。

PREP-KO不影响FMDV结合或内化但损害病毒复制

PREP-KO在IBRS-2和PK-15细胞中均表现出对FMDV感染的抵抗，但I型IFN信号通路上调仅见于PREP-KO IBRS-2细胞，提示其他机制也参与表型形成。为解答这一问题，研究人员进一步评估了PREP-KO是否影响FMDV的进入阶段。FMDV与PREP-KO和sgNC IBRS-2细胞的结合实验显示，病毒VP1蛋白荧光信号均定位于两种细胞的细胞膜上，表明病毒颗粒仍能结合PREP-KO细胞。此外，病毒内化后，FMDV颗粒与早期内体标志物EEA1的共定位模式在PREP-KO和sgNC细胞间无显著差异，表明早期内体介导的内化过程不受PREP敲除影响。RT-qPCR进一步证实，在结合和内化阶段，PREP-KO和sgNC细胞间的FMDV RNA无差异。

为探究PREP在进入后阶段的作用，研究人员用FMDV反向遗传学质粒转染PREP-KO和sgNC对照IBRS-2细胞，绕过结合和内化阶段。不同时间点测量的病毒滴度显示，PREP-KO细胞中的滴度显著低于对照。同样，转染后PREP-KO细胞中FMDV RNA依赖性RNA聚合酶3D的表达显著降低。为确定PREP-KO是否影响病毒复制，研究人员分析了IBRS-2细胞中FMDV RNA和蛋白合成的动力学。FMDV RNA水平在10 hpi开始增加，病毒RNA聚合酶3D和结构蛋白VP1分别在8 hpi和14 hpi检测到。聚焦病毒复制事件(MOI=0.01，至12 hpi)，发现PREP-KO细胞中FMDV VP1和3D蛋白的积累显著减少。考虑到PREP在调节FMDV蛋白翻译中的作用，研究人员进一步探讨了PREP是否影响FMDV内部核糖体进入位点(IRES)驱动的翻译。为此，他们使用了含有帽依赖性海肾荧光素酶(RLuc)和FMDV IRES驱动的萤火虫荧光素酶(FLuc)的双顺反子荧光素酶报告系统。PREP-KO细胞中IRES活性略有降低(从100%至83%)，但这一减少不足以解释FMDV蛋白积累的降低。病毒复制进一步分析显示，PREP-KO细胞中RNA合成显著抑制。由于病毒mRNA翻译和mRNA合成在FMDV感染过程中紧密关联，研究人员进一步分析了PREP-KO的影响是在复制还是翻译阶段。当用CHX抑制翻译时，PREP-KO细胞中的病毒RNA复制仍受抑制，表明主要缺陷在于RNA复制而非翻译。这些结果提示PREP对于病毒进入宿主细胞后的高效FMDV复制至关重要。

PREP抑制剂黄芩素处理的细胞中FMDV复制受抑制

为确定PREP抑制剂是否影响FMDV复制，研究人员用PREP抑制剂黄芩素处理FMDV易感细胞系(IBRS-2、PK-15和永生化猪肺泡巨噬细胞iPAM)，并评估其效果。该方法使研究人员能够评估PREP抑制对FMDV基因组复制的特异性影响，而不受PREP-KO IBRS-2细胞中I型IFN信号通路显著激活的干扰。细胞在FMDV感染前用100 μM黄芩素预处理3小时，感染后不同时间点收集样本分析。结果显示，黄芩素处理显著降低了FMDV VP1蛋白的积累，并损害了所有三种细胞系中的FMDV复制。随后，研究人员进行了药物添加时间点实验，在FMDV感染前后不同时间点(-3、-2、-1、0、+1、+2和+3小时)加入黄芩素，24 hpi收集样本分析。结果表明，黄芩素在感染后添加时抑制效果最强，在IBRS-2和PK-15细胞中均观察到显著效果。这些发现进一步证实PREP对FMDV复制至关重要。

抑制或敲除PREP提高小鼠FMDV攻击后的存活率

FMDV依赖宿主因子(包括PREP)进行复制等关键过程。体外实验中，选择性PREP拮抗剂黄芩素有效抑制了FMDV复制。为评估黄芩素的体内抗病毒效果，研究人员采用了小鼠FMDV感染模型。用30 mg/kg或50 mg/kg黄芩素预处理的四周龄雌性C57BL/6J小鼠，在攻击10³ TCID₅₀ FMDV后，存活率较DMSO对照组显著提高。此外，50 mg/kg黄芩素处理组小鼠心脏中的病毒载量在第3天时显著低于DMSO组，肝脏、肺和肾脏中也观察到类似的病毒载量降低。组织病理学分析显示，DMSO处理小鼠心脏、肾脏、肝脏和肺部存在广泛的炎症浸润和组织损伤，而黄芩素处理小鼠病理变化明显减少。为评估黄芩素在FMDV感染中的治疗潜力，研究人员在FMDV感染后0、0.5和1天用50 mg/kg黄芩素处理小鼠，结果显示黄芩素处理小鼠的存活率较DMSO对照组显著改善。这些结果表明黄芩素对FMDV具有预防和治疗作用。

为进一步研究PREP敲除的体内抗病毒效果，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了PREP-KO小鼠。Sanger测序证实PREP基因外显子3-4存在1,995 bp缺失，导致PREP蛋白表达缺失。攻击10³ TCID₅₀ FMDV后，PREP-KO小鼠的存活率高于野生型小鼠。此外，PREP-KO小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)在MOI=1感染FMDV后，病毒复制显著低于野生型MEFs。这些发现表明，药理学抑制和遗传学敲除PREP均能赋予对FMDV感染的保护作用，突出了PREP作为抗病毒药物开发和抗病动物育种的有前景靶点。

本研究通过多维度实验证实了PREP作为FMDV感染关键宿主因子的多重功能。在IBRS-2细胞中，PREP与PUM1相互作用，而PREP-KO通过蛋白酶体和凋亡降解途径降低PUM1稳定性。PUM1的 destabilization 增强猪RIG-I启动子活性，上调RIG-I和MDA5，从而激活I型IFN信号通路。在其他FMDV易感细胞中，PREP-KO在复制阶段抑制FMDV生命周期。体内实验进一步证明，PREP的药理学抑制和遗传学敲除均能有效抵抗FMDV感染。这些发现不仅揭示了PREP在病毒-宿主相互作用中的新功能，而且为开发针对FMDV的新型抗病毒策略提供了理论依据和实践基础。通过靶向PREP，未来可能设计出既能增强宿主先天免疫应答又能直接抑制病毒复制的双重作用药物，为口蹄疫的防控开辟新的途径。此外，基于PREP敲除的抗病动物育种策略也有望培育出对FMDV具有天然抵抗力的 livestock，从根本上减少疾病暴发的风险。