综述：母体外周血中无细胞RNA作为子痫前期的潜在生物标志物：一篇综述

《Reproductive Biology and Endocrinology》：Cell-free RNAs in maternal peripheral blood as potential biomarkers of preeclampsia: a review

本综述系统探讨了母体外周血中无细胞RNA（cfRNA）作为子痫前期（PE）新型非侵入性生物标志物的潜力。文章详细比较了cfRNA与传统蛋白标志物（如sFlt-1/PlGF）的优劣，指出cfRNA能提供妊娠期基因表达的动态、组织分辨视图，预测模型AUC值高达0.70-0.99。同时总结了mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA及piRNA等不同类型cfRNA在PE中的作用机制及临床应用挑战，为PE的早期预测和精准医疗提供了新视角。

　　

子痫前期的临床挑战与现有诊断方法的局限

子痫前期（PE）是一种相对常见的妊娠并发症，以妊娠20周后新发高血压（收缩压≥140 mmHg和/或舒张压≥90 mmHg）伴蛋白尿或其他母体终末器官功能障碍为特征。全球范围内，PE影响了2%-8%的孕妇，每年导致超过76,000例孕产妇死亡和500,000例围产儿死亡，造成了巨大的全球健康和社会负担。其发病分为两个阶段：初始的胎盘形成不良，随后是氧化应激和炎症反应。目前，分娩是唯一的根治方法，这使得PE占新生儿发病率和围产期死亡率的三分之一。

目前的风险评估多基于母体特征和病史，但效果有限。美国妇产科医师学会（ACOG）和英国国家卫生与临床优化研究所（NICE）的指南推荐使用血管生成相关指标，如可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFlt-1）和胎盘生长因子（PlGF），作为预测和诊断生物标志物。sFlt-1/PlGF比值低于38可用于排除疑似PE。胎儿医学基金会（FMF）开发的风险竞争模型结合了母体风险因素、平均动脉压（MAP）、子宫动脉搏动指数超声检查以及妊娠11-13周时母体血清PlGF水平来估算个体发生PE的风险。然而，这些方法的普遍问题包括阳性预测值低、敏感性有限以及适用性受限。

无细胞RNA：一种新兴的非侵入性生物标志物

随着Lo等开创性地在孕妇循环中发现胎盘来源的无细胞DNA（cfDNA），非侵入性产前检测技术取得了重大进展。近年来，研究重点已转向母体血液中的无细胞RNA（cfRNA）。与cfDNA不同，特定cfRNA的水平在妊娠期间会发生可预测的变化，并且与胎盘和胎儿基因表达相关。cfRNA不受染色体多态性影响，也不受母体背景干扰；此外，它们可能产生指数级放大的信号，显示出比cfDNA更高的敏感性和特异性。

cfRNA存在于母体血液中，源自胎儿、胎盘和孕妇自身的各种组织。它们主要通过凋亡、微泡脱落和外泌体信号等过程释放。证据表明，无细胞胎儿RNA（cffRNA）主要来源于滋养细胞的凋亡。胎儿组织细胞的脱落和胎儿造血细胞的释放也可能 contribute to 母体外周血中的cffRNA。与cffDNA类似，母体血浆中的cffRNA在分娩后迅速清除，表明胎盘是cffRNA的重要来源。在妊娠早期，cffRNA占总cfRNA的比例不到1%，在18周前增加到不到4%，24周后达到约15%。

作为动态生物标志物，cfRNA在作为非侵入性液体活检标志物方面具有独特潜力。首先，cfRNA可以提供关于孕妇、胎儿和胎盘之间相互作用的信息，因为某些病理状况可能会改变cfRNA的表达模式。其次，尽管具有单链结构且稳定性不如cfDNA，但cfRNA受到细胞外囊泡和凋亡体等亚细胞颗粒的保护，在母体外周血中可稳定存在长达24小时。此外，母体血浆中的cfRNA主要是片段化的，并且通常经过修饰以保护5'端免受核酸外切酶的降解，尽管3'端会降解。大多数与妊娠相关的cfRNA在分娩后数小时内从循环中清除。因此，母体外周血中的cfRNA水平理论上直接反映了基因表达模式，能够实现PE的早期检测。

cfRNA的种类及其与子痫前期的关联

母体血液中的cfRNA包括各种RNA生物型，包括信使RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA），主要是microRNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）和PIWI相互作用RNA（piRNA）。

信使RNA（mRNA）

与健康个体相比，PE患者母体血液中的mRNA水平存在差异。例如，胎盘特异性mRNA，如编码促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）的mRNA，在PE患者中水平较高，并在分娩后2小时内清除。CRH通过诱导一氧化氮合酶（NOS）表达或改变NOS激活，有效上调一氧化氮（NO）以扩张胎盘阻力动脉，表明CRH mRNA可能参与PE的病理生理过程。人胎盘催乳素（hPL） mRNA与异常侵入性胎盘有关，其水平可以预测异常侵入性胎盘，这可能与PE有关。胎盘特异性蛋白1（PLAC1）的表达仅限于滋养细胞来源的细胞，通过调节人胎盘滋养细胞的侵袭、迁移和合体化，对胎盘生长至关重要。P-选择素在植入、母体免疫耐受和螺旋动脉中的滋养细胞迁移中起关键作用。滋养细胞和子宫螺旋动脉都受到上述两个因素的影响， contribute to PE的发生和发展。

在一般性mRNA变化方面，研究发现PE患者母体血液中一组mRNA的中位水平与正常妊娠不同。此外，妊娠10-14周时，PE孕妇母体血液中内皮糖蛋白（Eng）、fms相关酪氨酸激酶1（FLT1）和转化生长因子-β1（TGF-β1）的mRNA水平高于健康孕妇。基质金属蛋白酶（MMPs）的胎盘表达与滋养细胞侵袭之间存在关系，这对PE的发展至关重要。在妊娠14周和28周时，PE患者血浆中MMP-2、MMP-9和MMP-15的mRNA水平显著高于健康孕妇，而MMP-14的mRNA水平较低。来源于胎盘和血管内皮细胞的肾上腺髓质素（ADM）在PE患者中的循环水平在妊娠28周和36周时下降，从而影响滋养细胞分化、血压和血管完整性。同样，与内皮细胞功能和血管生成调节相关的GATA2的循环mRNA水平在PE发病前12周就开始下降。

基于mRNA的预测模型也已被开发。例如，发现三个来自绒毛外滋养细胞特征的mRNA（MMP-11、溶质载体家族6成员2（SLC6A2）和白介素18结合蛋白（IL18BP）的组合，可以在妊娠11-17周时以83%的敏感性和94%的特异性预测早期PE。另一个基于七个与PE相关的RNA（CLDN7、PAPP-A2、SNORD14A、PLEKHH1、MAGEA10、TLE6和FABP1）的模型被开发用于预测PE。另一个包含母体血浆中七个mRNA的风险模型也显示出令人满意的预测能力。

非编码RNA（ncRNA）

ncRNA在包括个体发生、繁殖、凋亡和细胞重编程在内的各种生命周期活动中具有重要的病理和生理功能，并且与人类疾病密切相关。ncRNA可分为两大类：看家ncRNA和调控性ncRNA。看家ncRNA包括转移RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）和小核RNA（snRNA）。调控性ncRNA包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA和小干扰RNA（siRNA）。越来越多的证据表明miRNA、lncRNA、circRNA和piRNA与PE的发病机制有关。ncRNA可能通过多种机制在PE中发挥作用，包括抑制滋养细胞迁移、侵袭和增殖，以及诱导滋养细胞凋亡和内皮功能障碍。

MicroRNA（miRNA）

miRNA长度约为22-28个核苷酸，在转录后水平调控人类三分之一基因。异常的miRNA通过多种机制参与PE，包括调节间充质干细胞和滋养细胞功能、胎盘血管生成以及胎盘肾素-血管紧张素系统。例如，miR-210靶向钾通道调节因子1（KCMF1）、17β-羟基类固醇脱氢酶1型（HSD17B1）、非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2（PTPN2）、Notch1和血小板反应蛋白1型结构域包含7A（THSD7A）来调节滋养细胞功能和胎盘血管生成。miR-141和miR-520g抑制MMP-2表达，通过减少血管生成、滋养细胞迁移、侵袭和增殖 contribute to PE。母体血液中的C19MC miRNA（一个胎盘特异性miRNA簇）与PE相关，特别是miR-516-5p、miR-520h和miR-518b，它们在PE患者的血浆中上调。

在预测性生物标志物方面，miR-517-5p被确定为预测PE发作最准确的标志物，AUC为0.70，敏感性43%，特异性86.2%。外泌体来源的C19MC miRNA、外泌体中的miR-520a-5p和miR-525-5p在PE中表达水平较低。血浆来源外泌体中的miR-520a-5p、miR-525-5p和miR-517-5p单独或组合使用，预测PE的敏感性为50-60%，特异性为70-80%。利用母体血浆中的12种miRNA构建了一个早期预测PE的模型，AUC值达到0.86。miR-127-3p、miR-423-5p和miR-519a-3p的组合可以以84-100%的特异性完美预测PE。PE女性和正常孕妇母体外周血中的外泌体miRNA存在差异表达。外泌体中miR-136、miR-494和miR-495的表达水平在PE患者的外周血中升高，其中miR-136的敏感性和特异性分别为95%和100%。

长链非编码RNA（lncRNA）

尽管lncRNA（>200个核苷酸）不能直接影响蛋白质翻译，但它们在印迹调控、表观遗传学、细胞周期调控以及转录和转录后基因表达调控等多个生物学过程中起关键作用。在PE的胎盘和外周循环中已鉴定出大量差异表达的lncRNA。在PE中，lncRNA可能调节滋养细胞的侵袭、迁移和增殖、血管生成、蜕膜化、炎症和免疫反应。因此，lncRNA是PE潜在的诊断和预测生物标志物。胎盘中的lnc-TCL6诊断PE的AUC为0.8625。血浆中的lnc-AK002210、AF085938和G36948可用于诊断PE，AUC值分别为0.7575、0.7673和0.7956。lnc-BC030099已被确定为PE的独立预测生物标志物，AUC为0.713。

环状RNA（circRNA）

circRNA以闭环RNA形式存在，没有5'帽但有3'poly-A尾，这使其免于核酸外切酶的降解。circRNA可以作为miRNA海绵，吸收miRNA并调节其功能。它们调节线性剪接并与RNA结合蛋白相互作用。circRNA与PE有关，并可能作为重要的生物标志物。PE患者血浆和胎盘组织中的circRNA可以通过作为miRNA海绵，结合miR-519d-3p和miR-15b-5p，减轻miRNA对靶mRNA的抑制效应。它在胎盘PE中低表达，但在循环血液中高表达，这可能与合体滋养细胞凋亡增加有关。PE患者中circ-101,222的水平高于健康女性，AUC为0.706，敏感性65.61%，特异性68.54%。此外，circ-102,682和circ-104,820在PE胎盘组织中上调，AUC值分别为0.774和0.995。circ-0007121在胎盘中下调（AUC=0.720），敏感性77%，特异性70%。circ-0036877可以作为竞争性内源RNA（ceRNA），对早期PE检测的AUC为0.846，敏感性85.3%，特异性72.7%。

PIWI相互作用RNA（piRNA）

piRNA（24-41个核苷酸长）是一类与PIWI蛋白特异性相互作用的小型ncRNA，显示出对5'末端尿苷或第十位腺苷的偏好。它们通过转录或转录后机制调节基因表达。piRNA与肿瘤发生、转移和耐药性有关。考虑到胎盘侵袭与肿瘤转移的相似性，piRNA可能参与PE的发病机制，并可作为诊断和治疗的生物标志物。例如，通过小RNA测序发现PE胎盘组织中有41个上调和36个下调的piRNA，并证明它们与细胞外基质形成有关。三个piRNA（piR-1,256,314、uniq-271,431和uniq-277,797）在PE胎盘组织中上调，可能抑制滋养细胞增殖和侵袭并促进凋亡。

ceRNA调控网络在子痫前期中的作用

值得注意的是，ceRNA调控网络，涉及lncRNA/circRNA/miRNA，影响mRNA的表达。研究发现，在PE中，lnc-1492和has-circ-0088196的表达水平升高，而它们的靶miRNA miR-100-5p的水平降低。ncRNA可以影响多个靶基因或相互相互作用，以调节滋养细胞的增殖、侵袭、凋亡、自噬、炎症、血管生成和表观遗传学等生物学过程，这些在PE的发生和发展中起关键作用。

多组学方法在子痫前期诊断中的应用

近年来，多组学技术的应用为PE的诊断提供了新的见解。通过对母体外周血中的RNA进行多组学测序，我们可以更深入地了解cfRNA影响PE发病的机制。浅着床是由于滋养细胞浸润不足造成的，是PE发病机制中的一个关键因素。研究人员整合单细胞转录组数据和cfRNA，以非侵入性方式揭示了早发性PE胎盘中滋养细胞功能障碍。研究表明，PE患者的外周血具有特定的转录组特征，可用于区分正常妊娠和PE。通过对外周血单个核细胞（PBMC）进行转录组测序，研究人员发现PE患者的基因表达谱与健康孕妇显著不同。此外，研究还揭示，PE患者外周血中特定的cfRNA表达水平发生显著改变，这表明这些cfRNA可能作为PE的潜在诊断标志物。例如，研究表明miR-31-5p在PE患者的外周血中显著下调，并与血压和蛋白尿等临床指标呈负相关，表明miR-31-5p可能是PE的有效生物标志物。

RNA的多组学测序还揭示了PE患者外周血中免疫和炎症相关通路的显著改变。通过对外周血的转录组和蛋白质组进行联合分析，研究人员发现PE中免疫细胞亚群的分布发生了改变，特别是在T辅助细胞（Th细胞）中。通过对PE患者和健康孕妇的循环转录组进行测序和分析，研究人员已经确定了与胎盘功能障碍、胎儿发育受损以及母体免疫和心血管系统紊乱相关的转录本，这些是PE的特征。对cfRNA的多组学数据的整合分析可以识别与PE相关的关键分子和通路。这些研究成果不仅有助于揭示PE的分子机制，也为其早期诊断提供了新思路。

挑战与未来展望

单细胞方法强调了定义组织或细胞特异性的重要性。值得注意的是，cfRNA水平反映了来自多个组织的RNA，包括母亲、胎儿和胎盘的RNA，并且只有少数cffRNA已被识别。母体全身背景下产前cfRNA特征的特异性仍然未知；因此，与PE风险最密切相关的cfRNA来源尚不清楚。此外，cfRNA的分析提出了几个技术挑战，必须解决这些挑战才能充分发挥其作为各种临床应用生物标志物的潜力。主要挑战之一是循环中cfRNA的稳定性。与DNA不同，RNA由于其单链结构和对核糖核酸酶降解的敏感性， inherently 更不稳定。这个问题在临床环境中尤为关键，样本处理和运输必须确保cfRNA降解不会导致不准确的结果。改进稳定技术，例如使用RNA稳定剂或优化的收集方案，对于增强可靠性是必要的。

cfRNA数据的标准化是另一个关键挑战，因为它对于样本间的准确定量和比较至关重要。cfRNA群体的异质性，在个体之间甚至同一个体内部随时间推移可能显着变化，使标准化工作复杂化。这种可变性 necessitates 开发强大的标准化策略，以考虑cfRNA产量和组成的差异。检测限也对cfRNA分析构成重大挑战。循环中cfRNA的低丰度需要高度敏感的检测方法以确保可靠测量。测序技术和生物信息学工具必须改进以检测低丰度cfRNA，特别是当感兴趣的RNA仅占总cfRNA池的一小部分时。此外，缺乏关于cfRNA检测最佳时间的明确性也限制了这种方法的临床应用。

在将cfRNA作为PE的预测标志物应用于临床之前，需要考虑以下方面。需要进行全面的验证研究，以确定它们在不同人群和临床条件下的可靠性和稳健性。大型、多中心队列对于确保研究结果可推广且生物标志物在不同种族、民族和地理群体中保持一致的准确性至关重要。验证还应在妊娠的多个阶段进行，以考虑整个妊娠期间cfRNA表达模式的动态变化。验证之后，临床试验对于评估cfRNA的现实世界适用性至关重要。这个过程涉及确定cfRNA在早期诊断、预测疾病进展以及协助患者治疗监测中的作用。采用cfRNA-based诊断工具的成本必须仔细评估。与超声和血压测量等传统筛查方法相比，将cfRNA整合到临床实践中需要评估初始费用以及通过早期检测和改进PE管理带来的长期节省潜力。

结论

本综述总结了基于母体血液中cfRNA诊断和预测PE的研究现状。值得注意的是，确定cfRNA的来源及其与组织和细胞类型的关系对于理解PE中涉及的特定基因或基因通路至关重要。这些信息可以改进它们作为生物标志物的利用。该领域的研究才刚刚开始，需要精心设计的大规模前瞻性临床研究来支持和扩展其临床应用。涉及研究人员、临床医生和监管机构的协作方法对于克服当前挑战和释放cfRNA-based诊断在PE方面的全部潜力至关重要。通过对验证、机制阐明和检测优化的重点研究，我们可以期待无创产前诊断技术的显著进步，从而改善孕产妇和胎儿的健康结局。