Nox4+ GABA能神经元在三叉神经尾侧核中的选择性缺失与转录重编程在慢性偏头痛模型中的作用机制研究

《The Journal of Headache and Pain》：Selective loss and transcriptional reprogramming of Nox4+ GABAergic neurons in the trigeminal nucleus caudalis of NTG-induced chronic migraine model

本研究针对慢性偏头痛（Chronic Migraine）发病机制不清的难题，通过单核RNA测序（snRNA-seq）技术解析了硝酸甘油（NTG）诱导的小鼠三叉神经尾侧核（TNC）细胞图谱。研究发现了一类新型Nox4高表达的GABA能神经元亚群（GABA_Nox4），该群体在NTG模型中显著减少（p=0.018），并通过免疫荧光染色验证。进一步分析表明，GABA_Nox4神经元在慢性偏头痛状态下发生转录重编程，且与星形胶质细胞、内皮细胞等通过Agrn-Dag1、Ncam1-Ncam2等配体-受体对增强相互作用。该研究首次揭示了GABA_Nox4神经元作为TNC中易损的抑制性群体，为偏头痛的机制研究和靶向治疗提供了新视角。

　　

偏头痛是一种困扰全球约15%人口的慢性神经血管疾病，其中部分患者会逐渐发展为慢性偏头痛，严重影响生活质量并带来沉重社会经济负担。尽管血管活性神经调节剂如降钙素基因相关肽（CGRP）、垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）和一氧化氮（NO）等在偏头痛发病机制中作用已被广泛研究，但作为疼痛传导关键中枢的三叉神经尾侧核（Trigeminal Nucleus Caudalis, TNC）的细胞组成和分子特征仍不清楚。尤其在中枢敏化过程中，TNC神经元如何出现超兴奋性并放大伤害性信号，其细胞类型特异性机制尚不明确。近年来，单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）技术的发展为在单细胞分辨率下解析TNC的细胞异性和基因表达谱提供了前所未有的机会，有助于揭示慢性偏头痛形成和发展的细胞分子基础。

为解决上述问题，徐云浩等研究人员在《The Journal of Headache and Pain》上发表了题为“Selective loss and transcriptional reprogramming of Nox4+ GABAergic neurons in the trigeminal nucleus caudalis of NTG-induced chronic migraine model”的研究论文。该研究通过建立硝酸甘油（Nitroglycerin, NTG）诱导的慢性偏头痛小鼠模型，综合运用行为学测试、免疫荧光染色、单核RNA测序、高维加权基因共表达网络分析（high-dimensional weighted gene co-expression network analysis, hdWGCNA）、伪时序分析（pseudotime analysis）和CellChat细胞通讯分析等多种技术手段，系统描绘了TNC在慢性偏头痛状态下的细胞图谱和分子网络变化。

研究主要技术方法包括：① 建立NTG诱导的慢性偏头痛小鼠模型（每2天腹腔注射NTG，共5次），并通过行为学测试（von Frey filaments检测机械痛阈）和免疫荧光染色（c-Fos、CGRP表达）验证模型有效性；② 对TNC组织进行单核RNA测序，获得84,119个高质量核转录组数据，通过Harmony算法整合批次效应，UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）降维聚类识别主要细胞类型；③ 对神经元亚群进行再聚类，识别GABA能神经元亚群；④ 应用hdWGCNA构建基因共表达模块，Monocle进行伪时序轨迹分析，CellChat推断细胞间通讯网络。

NTG诱导慢性机械超敏反应和TNC激活

研究人员通过间歇性腹腔注射NTG建立了慢性偏头痛小鼠模型。行为学实验显示，NTG处理组小鼠在连续给药后，眶周和爪部机械痛阈基线水平逐渐下降，且注射后2小时痛阈持续低于对照组（VEH），表明模型成功诱导了持久性异常性疼痛。免疫荧光染色进一步证实，NTG组TNC区域CGRP免疫反应强度和c-Fos阳性神经元数量均显著增加，提示TNC神经元激活。

单核RNA测序识别TNC的7种主要细胞类型及神经元主导的偏头痛特征

snRNA-seq分析共鉴定出7种主要细胞类型：神经元（54.1%）、少突胶质细胞（34.7%）、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte Progenitor Cells, OPCs）、成纤维细胞和内皮细胞。通过计算基于Enrichr数据库偏头痛相关基因集的细胞富集评分（Migraine Score），发现神经元群体评分最高，表明神经元是TNC中偏头痛相关转录程序的主要载体。

神经元再聚类识别NTG中GABA_Nox4亚群的选择性缺失

神经元亚群再聚类识别出15个转录 distinct 的亚群，包括GABA能（Slc32a1⁺）、谷氨酸能（Slc17a6⁺）和胆碱能（Chat⁺）神经元。比例分析发现，NTG组中特征性高表达Nox4的GABA能神经元亚群（GABA_Nox4）比例显著降低（p=0.018）。免疫荧光双标染色（Nox4与NeuN）进一步验证了NTG组TNC中Nox4⁺/NeuN⁺神经元比例下降（p=0.0053），表明GABA_Nox4神经元在慢性偏头痛状态下发生选择性缺失。

hdWGCNA识别与偏头痛相关的神经元共表达模块富集于GABA_Nox4神经元

hdWGCNA分析在神经元中鉴定出8个共表达模块，其中Module 2（特征基因包括Kcna1、Esrrg、Myo16、Nefh）在GABA_Nox4神经元中显著富集。疾病富集分析显示Module 2与偏头痛伴先兆、精神抑郁和焦虑障碍等疾病显著相关，提示该模块在偏头痛病理中具有重要作用。

GABA能神经元伪时序分析揭示晚期程序（C1）与偏头痛富集

Monocle伪时序分析将GABA能神经元沿轨迹分为3个状态，GABA_Nox4神经元位于轨迹末端。伪时序差异表达基因聚类为5个模块（C1-C5），其中C1模块基因（如Kcnb2、Terf1）在伪时序后期表达上升，且疾病富集分析显示C1模块与偏头痛显著相关，表明GABA_Nox4神经元在慢性偏头痛状态下转向一个与疾病相关的晚期转录程序。

GABA_Nox4神经元在NTG和VEH条件下的细胞间信号动力学

CellChat分析显示，NTG条件下GABA_Nox4神经元与星形胶质细胞、内皮细胞和OPCs之间的相互作用数量和强度增强，涉及Agrn-Dag1、Ncam1-Ncam2、Ncam1-Fgfr1、Ncam1-L1cam等配体-受体对；而VEH特有的Pdgfa-Pdgfra/Pdgfrb信号则减弱。这表明在慢性偏头痛状态下，GABA_Nox4神经元的微环境通讯网络发生重编程，可能参与维持中枢敏化和神经血管单元功能失调。

讨论与结论

本研究通过整合单细胞转录组学分析，首次揭示了三叉神经尾侧核中GABA_Nox4神经元在慢性偏头痛中的关键作用。该神经元亚群的选择性缺失和转录重编程，以及其与周边胶质-血管单元通讯的增强，共同导致TNC区域兴奋-抑制平衡破坏，从而促进慢性偏头痛的病理进程。研究发现，GABA_Nox4神经元富集的共表达模块（Module 2）包含Kcna1（K_v1.1钾通道）和Esrrg（雌激素相关受体γ）等枢纽基因，前者调控神经元兴奋性，后者参与线粒体能量代谢，二者的失调可能加剧神经元氧化应激和能量耗竭，从而增强其易损性。伪时序分析进一步表明，GABA_Nox4神经元在疾病状态下转向一个与偏头痛相关的晚期转录程序（C1），其中Kcnb2（K_v2.2钾通道）的上调可能进一步削弱抑制性输出，导致局部三叉神经回路去抑制。

在细胞通讯层面，NTG条件下GABA_Nox4神经元通过Agrn-Dag1、Ncam1-Ncam2等信号通路与星形胶质细胞、内皮细胞等非神经元细胞互动增强，反映了疾病状态下神经-胶质-血管耦合的异常重构。而Pdgfa-Pdgfra/Pdgfrb等营养信号减弱，提示修复机制受损。这些发现不仅为理解偏头痛中枢敏化提供了新的细胞基础，也为开发针对特定神经元亚群的治疗策略提供了潜在靶点。例如，靶向Nox4活性或调控其相关通讯网络，可能有助于恢复TNC抑制性张力，逆转慢性疼痛状态。

研究的局限性包括仅使用雄性小鼠，未考察性别差异；缺乏功能性实验验证GABA_Nox4神经元的因果作用；以及NTG模型不能完全模拟人类偏头痛的所有特征。未来研究需结合性别因素、功能性操控（如化学遗传学/光遗传学）和人类组织验证，进一步阐明GABA_Nox4神经元在偏头痛中的具体机制和转化价值。

综上所述，该研究通过高分辨率单细胞技术揭示了GABA_Nox4神经元作为三叉神经尾侧核中一个关键易损群体在慢性偏头痛中的核心作用，为理解疾病发病机制和开发精准治疗策略提供了重要理论依据。