MASLD向肝硬化进展中的早期可变剪接特征与RBP调控网络研究

《BMC Medical Genomics》：Early alternative splicing signatures and RBP networks in MASLD progression to cirrhosis

本研究针对代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MASLD)向肝硬化进展的早期预测难题，通过分析健康对照(n=10)、MASLD患者(n=9)和肝硬化患者(n=10)的肝组织RNA测序数据，鉴定出671个差异可变剪接事件。研究发现与DNA损伤反应(DDR)和上皮间质转化(EMT)相关的剪接模式在疾病早期已出现渐进性改变，12个免疫相关剪接事件与免疫细胞群变化显著相关，11个RNA结合蛋白(RBPs)表达变化与疾病进展相关。该研究为早期诊断和干预提供了潜在分子标志物和治疗靶点。

　　

在全球范围内，代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MASLD)影响着约32.4%的成年人群体，这种疾病可从简单的肝脂肪变性进展为非酒精性脂肪性肝炎(MASH)、肝硬化，最终发展为肝细胞癌(HCC)。尽管大多数单纯性脂肪肝患者病情保持稳定，但约有20%-30%的MASLD患者会发展为MASH，其中10%-15%的病例可能进展为肝硬化。这种疾病进展的变异性背后的分子机制至今尚未完全阐明，特别是肝硬化早期发展的预测标志物缺乏，严重限制了临床医生对高风险患者的识别和早期干预。

可变剪接(Alternative Splicing)作为真核生物基因表达调控的关键机制，通过产生不同的mRNA异构体来影响细胞代谢、增殖和免疫应答等重要生物学过程。近年研究表明，剪接调控异常与MASLD向更严重肝病的进展密切相关。例如，SRSF6通过调控线粒体功能相关基因的剪接，其活性受到DRAK2抑制后会破坏线粒体功能，从而促进MASLD向MASH进展。类似的，ESRP2抑制介导的剪接重编程可使成人肝细胞逆转为未成熟状态，加剧肝损伤。值得注意的是，某些与肝硬化相关的剪接模式在MASLD阶段已经显现，提示存在"早期可变剪接特征"，可能预示着疾病进展。

RNA结合蛋白(RNA-Binding Proteins, RBPs)在RNA代谢中扮演着核心角色，通过识别特定序列/结构 motif，参与RNA剪接、运输、多聚腺苷酸化、定位、翻译和降解等转录后过程。研究表明，RBPs如SRSF3、HUR、TTP和QKI等在MASLD进展中发挥重要作用，它们通过调控剪接和mRNA稳定性来影响炎症反应。当这些RBP表达失调时，会导致RNA加工异常，进而促进肝功能异常、炎症和纤维化——这些都是MASLD及其向肝硬化进展的典型特征。

为了探究可变剪接和RBPs在MASLD向肝硬化进展中的作用机制，研究人员开展了一项系统性的生物信息学研究。该研究分析了来自SRA数据库(登录号ERP146053)的29例肝组织RNA测序数据，包括10例健康对照、9例MASLD患者和10例肝硬化患者样本。研究团队采用SUVA流程进行剪接事件检测，应用k-means聚类分析剪接模式的动态变化，并构建了RBP调控网络。通过整合免疫细胞组分分析，深入探索了疾病进展过程中剪接变异与免疫应答之间的相互作用。

主要技术方法包括：从SRA数据库获取RNA测序数据并进行质量控制和基因组比对；使用SUVA软件识别和量化可变剪接事件；采用k-means聚类分析剪接模式动态变化；利用CIBERSORT算法估算免疫细胞比例；通过DESeq2进行差异表达分析；构建RBP与剪接事件共表达网络。

识别肝组织中的差异可变剪接事件

研究人员利用SUVA流程成功鉴定出671个高度保守的受调控可变剪接(Regulated Alternative Splicing, RAS)事件，这些事件在pSAR(剪接位点使用比例)≥50%的标准下被筛选用于深入分析。分析显示，替代5'剪接位点(alt5p)事件是观察到的主要可变剪接类型。随着疾病从健康状态向MASLD和肝硬化的进展，异常剪接事件显著增加，表明剪接调控与疾病进展存在密切关联。

主成分分析(PCA)显示，健康组与MASLD组在剪接模式上存在显著差异，而肝硬化组则沿第一主成分与其他两组明显分离，表明疾病进展过程中剪接模式的异质性增加。比较分析发现，不同疾病阶段之间的剪接事件重叠有限，提示剪接调控具有高度阶段特异性，可能反映了MASLD进展不同阶段存在的独特调控机制。

疾病进展过程中可变剪接模式的动态变化

通过k-means聚类分析，研究人员将主要剪接事件分为四个 distinct 簇(C1-C4)，揭示了从健康状态到MASLD和肝硬化的不可逆剪接模式变化。特别值得注意的是，在C1和C2簇中，MASLD阶段的剪接变化与肝硬化阶段非常相似，表明显著的剪接调控异常可能在MASLD早期就已经出现，可能驱动疾病进展。

在C2簇中，剪接比值随着从健康向疾病的转变而降低。与这些剪接事件相关的基因在上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)的正向调控通路中显著富集。EMT通过促进肝纤维化、影响肝再生和参与局部炎症反应，在MASLD向肝硬化进展中发挥核心作用。研究人员展示了EMT相关关键基因(如CTNNB1、TNXB、PTK2、TGFB1I1)的可变剪接事件变化，发现剪接比值随疾病进展而降低。例如，PTK2基因的剪接事件显示随着疾病进展，外显子跳跃趋势增强。

在C1簇中，剪接比值呈现上升趋势。相关基因在DNA损伤反应(DNA Damage Response, DDR)通路中富集。热图分析表明，随着疾病进展，DDR通路基因的剪接比值增加。例如，KAT5基因显示随着疾病进展，中间外显子保留增加。这些发现揭示了MASLD向肝硬化进展过程中剪接模式的显著阶段相关性变化，为理解疾病发展的分子机制提供了新视角。

免疫相关可变剪接及其对免疫微环境的影响

研究人员使用CIBERSORT算法评估了免疫细胞组成的变化，发现随着疾病进展，免疫细胞比例发生显著改变。B细胞和T细胞增加，M0和M1型巨噬细胞上升，M2型巨噬细胞逐渐减少，肥大细胞减少，这些变化表明随着疾病进展，免疫活性增强和细胞基质积累。

研究人员重点关注了免疫相关基因的可变剪接事件，发现这些剪接事件的模式变化与疾病进展相对应。相关性分析鉴定出12个与免疫细胞比例改变显著相关的可变剪接事件。值得注意的是，大量这些剪接事件与巨噬细胞，特别是M0和M2亚型密切相关。这些结果表明剪接在疾病进展过程中对巨噬细胞活化和极化具有重要调控作用。例如，先前研究已证明PTK2与M2极化巨噬细胞的浸润相关。此外，调节性T细胞(Tregs)也与特定剪接事件表现出强相关性。这一分析表明可变剪接可能在MASLD向肝硬化进展过程中对免疫微环境的调节产生影响。

构建RBP与剪接事件的共调控网络

基于所有表达基因的PCA分析显示，正常组和MASLD组在基因表达水平上 distinct 但相似，而肝硬化组则表现出显著差异和更大异质性。差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)分析表明，与健康个体相比，MASLD的差异基因较少，而肝硬化患者则显示出显著的转录组差异。

热图分析显示，在肝硬化阶段大量RBP基因显著上调，而MASLD与正常条件之间的表达变化较不明显。然而，MASLD中的一个RBP亚集表现出与肝硬化相似的转录变化。具体而言，五个RBP(MOV10L1、SPTBN5、MKI67、NPM2、ZMAT3)在MASLD和肝硬化中相对于健康对照持续上调或下调。

研究人员通过Pearson相关性分析构建了RBP-RAS相互作用网络，将差异表达RBP的表达水平与RAS事件的剪接比值相关联。网络中的RBP-RAS对得到RNAinter数据库中的结合证据支持，表明与可变剪接存在潜在关联。值得注意的是，几个与EMT和免疫相关的RBP基因，如PCBP1、CELF5、ESRP1、U2AF1、VIM、IGF2BP2和CELF2，在MASLD和肝硬化进展过程中显著上调。这些RBP的上调可能与免疫和EMT相关的剪接事件有关。这一共调控网络突显了RBP通过剪接调控影响MASLD向肝硬化进展的潜在机制。

研究结论与意义

这项研究最重要的发现之一是在MASLD阶段已经存在 distinct 的可变剪接模式，并在肝硬化阶段变得更加明显。这些早期剪接变化，特别是与EMT、DDR、巨噬细胞极化和Treg细胞功能相关的那些，可能作为疾病进展的候选标志物。此外，在肝硬化阶段观察到的RBP上调表明这些RBP可能是这些剪接事件的潜在调节因子。

研究对免疫相关AS事件的分析揭示了与MASLD向肝硬化进展过程中免疫微环境改变相一致的显著变化。观察到的巨噬细胞等免疫细胞群增加，以及PTK2等基因中相应的剪接事件，表明剪接在调节免疫应答中发挥关键作用，从而促进炎症和纤维化。特别值得注意的是，特定剪接事件与M1和M2巨噬细胞比例之间的相关性表明可变剪接可能驱动肝脏内免疫细胞可塑性。

RBP与AS事件共调控网络的构建为了解MASLD进展的转录后调控提供了宝贵见解。CELF5和U2AF1等RBP在MASLD和肝硬化中的上调表明这些蛋白质在疾病发展过程中维持或破坏剪接稳态方面发挥关键作用。研究结果表明RBP失调可能直接导致肝硬化中观察到的剪接事件异质性增加。

这项研究也存在若干局限性。首先，分析基于一个规模适中的横断面队列(n=29)，缺乏外部或实验验证。其次，样本水平组织学和完整表型注释不完整，限制了阶段特异性解读。第三，肝硬化组的病因不同(主要是酒精性肝病/治疗过的乙肝)，因此MASLD-肝硬化对比不应被视为单一的MASLD轨迹。第四，免疫组成从bulk RNA-seq推断，混淆了组织驻留和浸润细胞。最后，研究未进行剪接事件或RBP结合的湿实验验证。

尽管存在这些局限性，该研究通过阐明MASLD在转录后水平的分子基础，为开发针对剪接调节因子的新型诊断和治疗策略奠定了基础，以减轻疾病进展。这些剪接变化，特别是DDR和EMT相关转录本中的那些，可能反映了MASLD中的早期分子改变，因此值得作为候选进展标志物进行进一步研究。免疫相关剪接事件的鉴定及其与免疫细胞群变化的关联为治疗干预提供了新途径。