氯化两面针碱通过靶向BUB1抑制结直肠癌的作用机制：多组学与分子动力学模拟的整合研究

《BMC Gastroenterology》：Nitidine chloride inhibits colorectal cancer by targeting BUB1: mechanistic insights from molecular dynamics simulation, spatial transcriptomics, and single-cell RNA sequencing

本研究针对结直肠癌(CRC)治疗疗效有限的临床难题，研究人员围绕天然生物碱氯化两面针碱(NC)的抗肿瘤机制开展多组学探索。通过分子动力学模拟(MDS)、空间转录组学和单细胞RNA测序(scRNA-seq)等技术，发现NC能稳定结合BUB1蛋白(结合能-8.8 kcal/mol)，破坏RAD21-BUB1轴功能，诱导细胞周期阻滞与凋亡。研究证实BUB1在CRC组织(SMD=1.77)和恶性区域高表达，且与免疫抑制微环境相关。该研究为NC作为靶向BUB1的天然抗CRC候选药物提供了理论依据。

　　

在全球范围内，结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)始终是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下。尽管目前手术、放疗和化疗等治疗手段不断进步，但肿瘤异质性、耐药性和转移等问题依然制约着临床疗效的提升。在这一背景下，从中草药天然产物中寻找高效低毒的抗癌成分成为研究热点。氯化两面针碱(Nitidine Chloride, NC)作为一种从传统中药中提取的天然生物碱，在前期的研究中显示出广谱的抗肿瘤活性，但其在结直肠癌中的具体作用靶点和分子机制尚未明确。

发表在《BMC Gastroenterology》的这项研究，首次通过整合多组学分析、分子动力学模拟和功能实验，系统揭示了NC通过靶向有丝分裂关键调控因子BUB1(Budding Uninhibited by Benzimidazoles 1)发挥抗结直肠癌作用的分子机制。研究人员发现，NC能够与BUB1蛋白稳定结合，破坏RAD21-BUB1信号轴，进而抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡，并逆转BUB1介导的免疫抑制微环境。这一发现不仅深化了对NC药理作用的理解，也为结直肠癌的靶向治疗提供了新的候选策略。

研究团队主要采用了以下关键技术方法：通过细胞活力检测(CCK-8)和裸鼠移植瘤模型评估NC的体内外抗肿瘤活性；利用转录组测序(RNA-seq)、单细胞RNA测序(scRNA-seq，数据来源GEO数据库 accession numbers GSM6061702-GSM6061704)和空间转录组学(采用公开数据并通过SpaCET软件包分析)解析BUB1的表达特征与空间分布；采用分子动力学模拟(Molecular Dynamics Simulation, MDS)分析NC与BUB1的相互作用；结合CRISPR基因敲除技术(依赖DepMap数据库)验证BUB1的基因功能；并通过免疫组化(IHC)、实时定量PCR(RT-qPCR)等实验进行多层面验证。

NC可抑制结直肠癌生长

研究首先通过CCK-8实验证实，NC对HCT116细胞的抑制作用呈现时间和浓度依赖性，其半抑制浓度(IC₅₀)随作用时间延长而显著降低。在裸鼠移植瘤模型中，NC治疗组(2、4、8 mg/kg，腹腔注射，隔日一次，持续2周)的肿瘤体积和重量均明显减小。HE染色和透射电镜结果进一步显示，NC处理后的肿瘤组织出现大量细胞坏死、核固缩、细胞膜破裂等凋亡特征，且肿瘤血管生成受到显著抑制。

BUB1是NC作用于HCT116的潜在靶点

转录组测序发现，NC处理后可显著下调HCT116细胞中多个细胞周期相关基因的表达。蛋白质相互作用(PPI)网络分析显示，BUB1位于下调基因网络的核心位置，与BUB1B、MKI67等关键细胞分裂蛋白密切互作。GO和KEGG富集分析表明，这些基因显著富集于“细胞周期”、“DNA复制”和“微管结合”等通路。

分子动力学模拟结果显示，NC与BUB1蛋白可形成稳定的复合物，其结合自由能为-8.8 kcal/mol。在100 ns的模拟过程中，复合物的均方根偏差(RMSD)和回转半径(Rg)均保持稳定，表明结合构象较为稳定。进一步的能量分解分析发现，范德华力(△Evdw = -173.989±1.819 kJ/mol)是主导结合的主要作用力，关键结合氨基酸包括LEU-793、ILE-945等。

BUB1在CRC单细胞水平的表达特征

通过单细胞RNA测序分析，研究人员在CRC样本中鉴定出9种主要细胞类型，包括上皮细胞、成纤维细胞、T细胞等。BUB1在上皮细胞和增殖相关细胞亚群中呈现高表达。细胞通讯分析显示，上皮细胞与成纤维细胞之间存在强烈的相互作用，而代谢分析则揭示了不同细胞类型在糖酵解、三羧酸循环(TCA cycle)等代谢通路中的异质性。

BUB1在CRC组织水平的空间表达模式

空间转录组分析显示，BUB1的表达在肿瘤恶性区域(红色-黄色标记)显著富集，其表达评分接近1.0。空间聚类将组织划分为7个功能簇区域，信号通路网络分析表明，在MK和MIF等通路中，不同簇区域之间存在复杂的相互作用，提示BUB1可能通过调节特定信号通路参与肿瘤细胞与微环境的通讯。

BUB1与免疫微环境的相关性

免疫相关分析发现，BUB1高表达与抗原呈递分子(HLA-A/B/C等)、免疫抑制因子(TGFBR1、CD276)以及多种趋化因子及其受体呈负相关。通过多种算法(CIBERSORT、EPIC、xCell等)评估免疫细胞浸润水平，结果显示BUB1高表达与Immunescore、Stromalscore以及B细胞、M2巨噬细胞、癌症相关成纤维细胞等免疫细胞的浸润程度呈负相关，表明BUB1可能通过抑制抗肿瘤免疫应答促进肿瘤进展。

BUB1基因敲除抑制CRC细胞生长

利用CRISPR基因敲除技术，研究团队发现BUB1在多个CRC细胞系中高表达，其基因依赖性评分(CRISPR score)为负值(如HCT116中约为-1.0)，表明敲除BUB1可显著抑制细胞增殖。在CCK81、SNUC5和SNU81等细胞系中，敲除BUB1的抑制效应最为明显(CRISPR score接近-1.5)，进一步证实了BUB1在维持CRC细胞生存中的关键作用。

NC可下调BUB1表达

转录组测序和qPCR验证均表明，NC处理可显著降低HCT116细胞中BUB1的mRNA表达水平。体内实验通过免疫组化检测发现，NC能够以剂量依赖的方式下调移植瘤组织中BUB1的蛋白表达，高剂量组(NC-H)的抑制效果与阳性对照5-Fu组相当。

NC可能通过RAD21-BUB1轴发挥作用

多组学整合分析提示，NC可能通过靶向RAD21-BUB1轴发挥抗CRC作用。Venn图分析显示，RAD21位于BUB1正相关共表达基因(BUB1-PEG)、HCT116转录因子调控基因集、CRC高表达基因集(SMD>0)以及NC处理后下调基因的交集核心位置。多数据集相关性分析证实，RAD21与BUB1在多个独立的CRC数据集中均呈现稳定的正相关关系(R值普遍>0.25)。此外，转录组火山图显示NC处理后RAD21表达显著下调，SMD分析也进一步验证了RAD21在CRC组织中的高表达。

讨论与结论

本研究通过多学科交叉的策略，系统阐明了天然化合物NC通过靶向BUB1抑制结直肠癌的新机制。研究发现不仅证实了BUB1作为CRC恶性进展的关键驱动因子，还揭示了其与肿瘤免疫微环境抑制的密切关联。分子动力学模拟为NC与BUB1的特异性结合提供了结构基础，而单细胞和空间转录组分析则从时空维度刻画了BUB1的表达特征和功能网络。

值得注意的是，RAD21-BUB1轴的发现为理解染色体稳定性调控与肿瘤发生提供了新的视角。RAD21作为黏连蛋白复合体的核心组分，其与BUB1的协同作用可能在于维持有丝分裂过程中染色体的正确分离。NC干预可能破坏这一精密调控网络，进而触发细胞周期检查点激活和凋亡程序。这一机制与近年来关于靶向染色体分离复合物可有效抑制肿瘤增殖的研究趋势相吻合。

此外，研究也存在一定局限性。例如，主要实验集中在HCT116细胞系，未来需要在更多遗传背景各异的CRC细胞模型中进行验证；虽然裸鼠移植瘤模型证实了NC的体内疗效，但该模型难以完全模拟人体肿瘤微环境的复杂性；NC的体内药代动力学特性也有待进一步评估。

综上所述，该研究不仅揭示了NC抗结直肠癌的分子靶点和作用通路，也为基于天然产物的肿瘤靶向治疗策略开发提供了重要理论依据。未来研究可进一步探索NC与现有化疗药物或免疫检查点抑制剂的联合应用潜力，推动其向临床转化。