一种非接触式的原位检测方法，利用荧光光谱技术来识别流动水中的荧光微塑料颗粒

《Environmental Science: Advances》：A non-contact in situ approach for detecting fluorescent microplastic particles in flowing water using fluorescence spectroscopy

微塑料污染检测新技术研究：结合荧光光谱与干涉式粒子成像实现流动水实时分类

　　微塑料（MP）污染正日益成为对水生生态系统乃至人类健康构成威胁的问题。这种污染不仅影响海洋环境，还可能通过食物链影响人类。当前，检测微塑料的方法通常依赖于复杂的实验室操作，如拉曼光谱或傅里叶变换红外（FTIR）光谱，这些方法需要大量的样品前处理、昂贵的仪器设备以及耗时的分析过程，限制了它们在原位监测中的应用。然而，为了进行可靠的环境评估，必须能够直接在流动的水体中持续检测微塑料颗粒。本研究探讨了结合荧光光谱分析和干涉粒子成像（IPI）技术的可行性，后者基于粒子对相干光的散射以及对干涉图案的检测，用于识别和表征在流动条件下的荧光微塑料颗粒。在实验初期，每种技术分别进行了评估，以确认其适用性。实验中使用了带有和不带有荧光染料的聚丙烯（PP）颗粒，将其悬浮在流动池中，并用445 nm波长的激光二极管进行照射。随后记录了荧光光谱和失焦的粒子图像。光谱分析聚焦于发射峰位置、半高宽和强度比，而IPI则提供了关于粒子类型和尺寸的信息。荧光光谱法能够根据发射峰的位置明确区分两种主要的粒子类别（黄色/绿色与橙色/粉色），而强度比和数值聚类（PCA和随后的LDA）进一步实现了更细致的分类。纯PP颗粒作为阴性对照，证明了荧光信号来源于染料而非聚合物基质。然而，绝对荧光强度因粒子尺寸、染料种类和取向等因素而存在显著变化，因此不可靠。IPI图像能够区分气泡与PP颗粒，并显示出尺寸估算的潜力。这些结果表明，两种技术在流动条件下都具备可行性，为微塑料的原位监测提供了一条更简单且更稳健的路径。

微塑料污染的环境意义不容忽视。其持久性、普遍性和潜在的生态与健康影响使得该问题成为全球关注的焦点。然而，微塑料的来源、去向和浓度分析仍然面临挑战，这主要是由于采样限制和传统实验室分析的耗时性。目前，分析微塑料浓度的方法（如手动采样、过滤、显微镜分析、FTIR或拉曼光谱）都需要先进行采样和过滤，然后才能进行实际测量。这种过程可能需要数周时间，从而限制了对污染动态的实时监测能力。为了确保可靠、长期和大规模的测量，需要采用能够在适当时间分辨率下进行连续过程采样的原位解决方案，以在不同地点获得可比的检测结果。鉴于微塑料浓度通常较低，可靠检测尤为关键。虽然并非所有颗粒都需要被全面检测，但准确性至关重要：所有检测到的颗粒都必须被明确识别为微塑料。因此，本研究旨在探索一种结合荧光光谱分析和粒子尺寸测量的流动水体检测方法，以提供更简单且更稳健的微塑料原位监测路径。

在微塑料的流动水体检测中，单独在静态实验室条件下进行分析是不够的。可靠的污染水平评估要求在水流动态中对微塑料颗粒进行直接检测和表征。这种流动检测方法能够提供更高的时间分辨率，并避免因复杂的样品制备、储存和运输过程而产生的潜在误差。近年来，已有多个实验研究尝试使用不同的物理原理进行连续流动检测。例如，基于流动的拉曼光谱已被证明能够识别水中的微塑料。Gl?ckler等人结合弹性光散射与拉曼光谱，实现了一种在单一测量中对微塑料进行分类和尺寸测定的方法。尽管这些研究提供了概念验证的结果，但它们的复杂性、对荧光干扰的敏感性以及对昂贵光谱仪器的依赖，限制了其在原位部署中的实用性。此外，Colson等人使用阻抗光谱法来量化微塑料，但未能区分不同类型的塑料。

为了应对上述挑战，荧光光谱技术被认为是一种有前景的解决方案。此前的研究主要依赖于使用如尼罗红等荧光染料对微塑料进行染色，然后进行荧光显微镜或成像分析。例如，Maes等人开发了一种基于尼罗红染色和图像分析的快速筛选方法，实现了对环境样品中微塑料的快速定量分析。Prasad等人进一步研究了尼罗红染色微塑料在不同激发条件下的荧光光谱，显示发射峰的位置和形状对聚合物识别具有重要价值。Ho和Feng引入了一种多光谱成像方法，结合尼罗红染色和聚类算法，以区分不同聚合物的荧光响应，突显了自动化分类方法的日益重要。Pizzoferrato和Bianco等人开发了便携式检测器，使用尼罗红染色进行流动微塑料检测，而Li和Kaile则利用流式细胞术检测染色微塑料，甚至可以达到亚微米尺度。

然而，这些方法在技术复杂性和适用性方面仍存在不足，难以在原位环境中广泛部署。尼罗红染色虽然简单且成本较低，但存在染料渗出、自然有机物和色素的干扰，以及在环境样品中容易产生假阳性的风险。相比之下，利用常见聚合物的固有或杂质相关的荧光特性进行分类是一种更可行的替代方案。聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）和聚苯乙烯（PS）是海洋污染研究中常见的塑料类型。虽然PE和PP作为烯烃类聚合物在纯态下不具有固有荧光，但它们通常含有荧光杂质。PS则在纯态下具有固有荧光。利用这些特性可以实现无需化学染色的微塑料分类。

对于有效的原位检测，一种技术必须能够同时捕捉流动中单个微塑料颗粒的荧光信号，并测定其尺寸、速度、体积和表面积，以评估污染程度和潜在的化学相互作用。因此，本研究探讨了将荧光表征与粒子尺寸测定相结合的可行性，旨在为微塑料的原位监测提供更简单和更稳健的解决方案。研究重点在于具有可靠荧光特性的微塑料颗粒，以展示其在流动环境中的可行性。实现对单一微塑料类型的定量检测将是一个重要的进展，为后续多类别的分类提供基础。

为了分析流动系统中的微塑料，研究团队制备了带有不同荧光染料的PP颗粒，并将其加入液体中。随后，样品被泵入测量区域，并通过激光二极管进行照射。在单独的实验中，分别记录了荧光光谱和失焦的相机图像，以研究相关现象。测量区域的设置是本研究的核心部分，其中使用了一种具有2 mm厚度的比色皿，安装在特定的支架上，以确保其在LINOS Microbench cube 30设备中的稳定操作。比色皿可以水平或垂直方向旋转，以便调整检测体积。在本研究中，比色皿被水平放置，使其高度为2 mm，深度为10 mm，以确保检测体积中尽可能多的颗粒。样品储存在样品瓶中，通过连接至测量区域和一个收集瓶的管道进行输送。样品瓶与收集瓶之间的高度差可以调节，以控制样品的流动方向。

激光二极管（PLPT5 447 KA，ams-OSRAM AG）用于照射样品，其发出的可见激光辐射可能对眼睛造成伤害。因此，所有实验均在符合IEC 60825激光产品安全标准的前提下进行，采取了适当的防护措施，如光束封闭和激光安全护目镜。激光二极管的光谱（由Avantes AvaSpec-2048x14光谱仪记录）显示其最大发射波长为440 nm，略微偏离数据表中指定的445 nm波长，这可能与激光二极管在光谱记录时的较低环境温度有关。在439 nm至442 nm的最大范围内，测量到的强度计数比周围光谱区域高出近两个数量级。激光二极管的输出功率为0.3 W，使用Newport Spectra-Physics GmbH的功率计测量。由于激光的强发散性，无法精确指定进入测量体积的光功率。激光二极管由iC-Haus GmbH的评估板驱动，采用自动电流控制（ACC）模式，以确保恒定的二极管电流。光功率可通过可变电阻器调整，以确保各样品的荧光信号能够清晰地区分于光谱仪的噪声。

IDS单色相机（UI-3060CP-M-GL Rev. 2，IDS Imaging Development Systems GmbH）通过USB线连接至计算机，用于记录测量体积的视频。相机配备了固定焦距镜头（50 mm，Cosmicar Television Lens 50 mm 1?:?1.8，Cosmicar Optical Co., Ltd）和40 mm的延伸环。镜头首先调整以获得测量体积的清晰图像。随后，相机和镜头被移离测量体积，直到图像变得失焦，但仍能识别单个颗粒。镜头安装点与比色皿中心之间的距离设定为约19 cm，这对于IPI技术至关重要，因为由此产生的干涉图案编码了关于颗粒尺寸和结构的信息。干涉图案的精确度通过经验性调整来优化。

使用光纤准直器（10 mm孔径UV/VIS光纤准直器，SMA，Edmund Optics GmbH）和一个光纤重聚焦组件（10 mm孔径，25 mm焦距UV/VIS光纤重聚焦组件，Edmund Optics GmbH），测量体积中散射的光被耦合至一条光纤（0.22 NA UV/VIS跳线，400微米光纤，SMA连接器，Edmund Optics GmbH），从而连接准直器与光谱仪，以记录光谱。光纤适配器的最优插入位置首先通过调整光纤准直器确定。为此，光纤连接至适配器并进行背光，将适配器插入准直器中，以确保在屏幕上产生的光斑直径最小。测量准直器与屏幕之间的距离被记录，随后将准直器放置在测量区域，使比色皿中心与重聚焦组件之间的距离与之前记录的距离相同。最后，准直器被定位，使得相机对面的图像中光斑在比色皿中垂直居中。

相机和准直器被放置在相对位置，以从侧面观察测量体积。通过这种方法，可以确保在流动条件下对微塑料进行有效的检测和表征。在本研究中，使用了四种带有不同荧光染料的PP样本，以及一个不含染料的PP样本。PP被选为代表性聚合物，因为其在海洋微塑料污染中较为常见。为了获得带有荧光染料的PP颗粒，研究团队使用了四种颜色的商用荧光笔帽（OTTO Office Textmarker Highliner Keilspitze，OTTO Office GmbH & Co. KG），这些笔帽由固有染色的PP制成，颜色范围涵盖了可见光谱中的不同发射峰值，为评估光谱区分提供了代表性样本。这种方法避免了额外染色的需要，从而防止了与表面处理或染料吸附相关的潜在误差。

为了准备用于光学实验的样本，将相应颜色的笔帽剪成小块，然后用文件将其破碎成颗粒，并通过0.5 mm的筛子进行过滤。这确保了颗粒的最大尺寸约为500微米，以防止比色皿堵塞。过滤后的颗粒被放置在测试管中，并用软木塞密封，以防止外来颗粒的进入。同样的方法也被用于准备不含荧光染料的PP样本，其来源是一个用于橙子的桶（Kaufland Dienstleistung GmbH & Co. KG）。通过这种方法，研究团队获得了稳定且可区分的荧光信号，为后续实验奠定了基础。

在实验过程中，研究团队还探讨了如何通过调节样品的密度来确保PP颗粒在液体中漂浮。PP的密度低于蒸馏水，因此需要使用异丙醇与蒸馏水的混合物来降低液体密度。异丙醇的密度为0.785 kg/L（在20°C时），蒸馏水的密度约为0.998 kg/L。PP的密度约为0.91 kg/L。因此，混合物的体积应为300 mL，通过计算异丙醇的体积来达到这一目标。最终混合物的密度为0.91 kg/L，使PP颗粒能够漂浮。将异丙醇-水混合物加入含有待测微塑料样本的实验室螺旋瓶中，直到悬浮液体的体积达到200 mL。通过这种方式，研究团队确保了PP颗粒在液体中的均匀分布。

为了进一步分析PP颗粒的荧光特性，研究团队使用了Python的SciPy库及其信号模块，通过find_peaks和prominences函数检测光谱中的最显著峰值。设置了一个0.1的峰值突出度阈值，以区分不同的荧光信号。对于每个测量系列，计算了峰值突出度大于0.1的谱峰数量，并将最低值作为分析的基准。这种方法确保了不同颗粒类型的更好可比性。在本研究中，选择了30个光谱进行分析，以评估不同颜色PP颗粒的荧光特性。通过这种方法，研究团队能够有效区分不同的PP颗粒。

在分析PP颗粒的荧光特性时，研究团队发现黄色和绿色颗粒的发射峰具有较宽的半高宽（FWHM > 55 nm），而橙色和粉色颗粒的发射峰则较窄（FWHM < 40 nm）。这些结果在箱线图（见图6）中得到了进一步支持，表明黄色和绿色颗粒的发射峰位于相似的光谱区域，而橙色和粉色颗粒则表现出明显的红移发射。这一现象与所使用的染料的颜色相一致，因此可以据此区分这两种类型的PP颗粒。然而，发射峰的强度存在显著差异，这使得基于绝对强度的区分变得不可靠。例如，橙色PP颗粒的发射强度最高，其次是黄色，而绿色和粉色颗粒的强度则明显较低。这种强度差异可能受到颗粒尺寸、位置和相对于激发光和光谱仪的取向的影响。此外，样本方差较大，不同样本的峰值强度存在显著重叠，因此仅凭发射强度无法可靠区分PP颗粒。

为了进一步研究PP颗粒的荧光特性，研究团队引入了一个基于Ornik等人方法的新参数。该方法将光谱信息浓缩为两个选定波长的强度比，从而能够通过绘制这些比值来区分不同的样本。在本研究中，选择了两个波长（λ? = 471.8 nm，λ? = 589.7 nm），以最大程度地提高不同PP样本之间的区分能力。通过这种方法，研究团队能够有效区分PP颗粒，并展示其在流动条件下的分类潜力。在测试数据中，PP颗粒的强度比值分布进一步验证了这一方法的有效性。例如，黄色/绿色PP颗粒的强度比值较低（<1.2），粉色颗粒的强度比值处于中间范围（3.3–10.4），而橙色颗粒的强度比值较高（>15.8）。这些结果表明，即使使用单一强度比值，也能捕捉到不同样本之间最显著的光谱差异，从而为分类提供可靠且高效的基础。

为了进一步优化PP颗粒的分类，研究团队采用了两阶段的降维流程。由于橙色和粉色颗粒的光谱高度相关，纯类别的无监督方法（如PCA）可能无法获得最优的分类特征组合。PCA通过最大化总方差来减少维度，但不考虑类别标签。因此，研究团队结合了无监督的PCA和有监督的线性判别分析（LDA），以获得优化的分类坐标。尽管这种方法不如强度比值方法那样直观，但其在分类性能上具有明显优势。在三类PP颗粒的情况下，LDA最多可以产生两个线性判别轴。这两个轴共同解释了100%的类别间方差，其中LD?解释了75%，LD?解释了剩余的25%。这些轴足以清晰区分PP颗粒的类别，如图8a所示。通过计算每个PP类别的平均轮廓系数（SC），研究团队进一步验证了分类方法的有效性。SC值在0.800至0.841之间，表明数值聚类方法在分类性能上略优于强度比值方法，尤其是在粉色颗粒的分类上表现出更显著的改进。这一结果表明，数值聚类方法能够更一致和均衡地区分所有PP类别。

在验证分类方法的泛化能力时，研究团队采用了监督分类框架。已分析的光谱作为训练集，而独立的测量系列则作为测试数据。对于每个原始颜色类别，研究团队记录了30个光谱，共计120个测试光谱。黄色和绿色颗粒再次被合并为一个类别，因此测试数据中黄色/绿色颗粒为60个，橙色和粉色颗粒各为30个。通过使用k-最近邻算法（k=5，欧几里得距离），研究团队能够比较两种特征提取方法的分类性能。在训练集和测试集上，所有评估指标均达到1.0，表明两种方法在这些控制条件下都能实现准确且可重复的分类。这种完美分类结果为后续的复杂数据集测试奠定了基础。然而，将这一基准应用于真实环境样品仍是一个关键挑战，因为环境中的微塑料可能因风化、碎片化和生物附着而表现出更大的变异性。

在干涉粒子成像（IPI）的初步测试中，研究团队记录了PP颗粒和气泡的图像，以评估其在该测量设置下的区分能力和尺寸估算潜力。如图9所示，这些图像展示了PP颗粒与气泡之间的差异，基于它们的干涉图案。根据Albrecht等人的描述，固体颗粒如PP会产生斑点图案，而气泡则显示干涉条纹。此外，粒子的尺寸可以通过这些结构的大小进行推断：较小的固体颗粒会产生较大的斑点，而较大的固体颗粒则会产生较小的斑点。相反，较小的气泡会显示较少的干涉条纹，而较大的气泡则会显示更多的条纹。为了研究粒子尺寸对荧光响应的影响，并展示成像与光谱分析的初步同步性，研究团队手动选择了不同尺寸的橙色PP颗粒，并在两个通道中分别记录了IPI图像和对应的荧光光谱。如图10所示，这些图像和光谱展示了随着粒子尺寸的增加，IPI图像中的斑点结构变得更精细，而光谱中的荧光强度也随之增加。这些结果表明，荧光信号与粒子的有效散射和发射体积相关，而光谱形状则保持了染料类型的特点，尽管在低信号水平下可能受到噪声的轻微影响。

尽管本研究取得了积极进展，但仍存在一些挑战和局限性。例如，粒子尺寸、形态和取向的变化可能会影响检测到的荧光强度。较大的或取向更合适的颗粒会产生更强的信号，而较小的或取向不佳的颗粒则会产生较弱的发射。这种影响通过手动同步的IPI-光谱测量得到了定性评估。然而，目前尚未建立将IPI尺寸指标与绝对荧光强度定量校准的方法。因此，目前的评估只能比较粒子之间的相对尺寸差异。未来的研究将专注于开发校准程序，以评估尺寸测定的准确性，并在真实海洋条件下测试粒子区分的稳健性。手动同步的采集方式是向完全集成的IPI-荧光测量系统迈出的中间一步。

此外，弱荧光信号的微塑料颗粒仍然是可靠检测的一个限制因素。虽然本研究未重点研究这些颗粒，但它们在未来的探索中具有重要意义。为了增强激发效率和信号强度，未来实验将研究使用更宽光谱范围的光源，以及高功率紫外激光，以在更广泛的材料中诱导荧光。这些方法有望增强微塑料与其他海洋材料（如沙子、藻类或沉积物）的区分能力，并提高对微小颗粒的检测精度。同时，研究团队正在开发一种具有增强紫外灵敏度的定制光谱仪（230 nm–400 nm）以及改进的光学设置，包括对激发光和杂散光的光谱过滤，以提高弱荧光检测的精度。由于本研究的重点是基于荧光的分类，而不是绝对强度分析，这些变化被视为可接受的，以支持概念验证。然而，未来研究仍需系统评估粒子尺寸和形态对分类准确性的影响。

最后，研究团队认识到一些实验限制。长时间的照射可能导致光漂白，从而随着时间的推移降低荧光强度。此外，当前设置中缺乏IPI成像与光谱仪读数之间的自动化同步机制，阻碍了对每个颗粒尺寸和荧光特性的同时测量。虽然目前的设置实现了手动同步，但这只是向完全集成系统迈出的一步。未来实验将引入硬件触发单元，以实现同步采集。同时，当前设置中未实施主动的样品流动控制，因为恒定的流动条件在本概念验证研究中并非关键。未来实施中将包括一个由泵驱动的循环系统，并通过反馈回路监控和稳定体积流量。

通过解决这些挑战，未来的研究将进一步完善该方法，提高微塑料检测和分类的准确性、稳健性和泛化能力。这些进展将有助于建立更可靠的框架，用于在水生环境中对微塑料进行原位检测和分类。