通过 vat 多材料 3D 打印技术制造集成微流控网络的细胞培养装置

《Journal of Materials Chemistry B》：Fabrication of cell culture devices with integrated microfluidic networks via vat multimaterial 3D printing

动态细胞培养和3D凝胶甲基丙烯酸甲酯（GelMA）支架的微流控96孔板开发

　　在过去的百年中，体外模型如细胞培养系统已成为医学和生物学研究的重要工具。然而，这些传统模型通常以静态方式培养细胞，无法完全模拟体内复杂的生长环境，例如持续的营养和氧气供应以及废物的排出。为了解决这一问题，本研究提出了一种名为“BioFlowWellplate”的双材料微流控培养皿，该装置通过微流控系统将各个培养孔相互连接，从而实现了动态细胞培养。这一创新设备的制造采用了数字光处理（DLP）技术，这是一种先进的增材制造方法，能够精确地实现计算机辅助设计（CAD）模型中的复杂几何结构。此外，该设备采用了多种材料的打印策略，选择两种不同的可打印树脂：一种是聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA 250），它能够促进细胞附着，并在薄层打印时具有良好的透明度；另一种是TEGORad? 2800，它具备优异的细胞相容性以及较低的药物保留特性。通过这种多材料打印方法，BioFlowWellplate为研究人员提供了一种节省时间、更可控的实验流程，并且能够实现细胞在动态条件下的培养，从而提升体外模型在转化研究中的生理相关性。

在这一背景下，动态培养装置具备多项优势，例如减少试剂用量、快速响应时间、低成本制造、高紧凑性以及良好的可扩展性。此外，为了便于观察细胞培养的整体状态，这些装置通常需要具备透明部分。然而，目前市面上的商业解决方案虽然成功地将细胞培养与微流控技术结合，但仍存在一些局限性。例如，流体的流动通常通过摇摆驱动的振荡方式实现，无法再现人体循环系统中连续、单向的流动模式，这对于模拟体内环境至关重要，尤其是在涉及剪切力敏感细胞类型或药物扩散研究的应用中。此外，这些商业设备通常具有固定的几何形状、体积和连接方式，限制了实验设计的个性化需求。相比之下，更具个性化能力的微流控平台通常通过注射或复制铸造聚二甲基硅氧烷（PDMS）来制造，但这些方法涉及多个步骤，导致制造过程依赖操作者，耗时较长且材料浪费严重。更重要的是，这些传统技术无法在同一设备中实现多种材料的整合。

从材料角度来看，PDMS因其透明性、机械柔韧性和良好的细胞相容性，在生物医学应用和显微镜观察方面具有吸引力。然而，PDMS在药物测试中受到了批评，因为它容易吸收小分子的疏水性物质，如大多数药物，这会导致目标分子的可用性低于预期。因此，开发一种能够模拟PDMS特性但又能实现3D打印的材料，成为动态细胞培养设备制造的一个重要方向。目前， vat聚合技术，如DLP，是实现这一目标的有力候选。这种增材制造技术基于光聚合，能够直接打印出具有高精度的复杂几何结构。由于其使用液体配方，使得材料设计更加灵活。与基于挤出或喷墨的多材料打印相比，DLP技术具有更高的分辨率、更光滑的表面和更好的光学透明度，这对封闭的微流控通道和细胞成像至关重要。此外，适用于vat聚合的细胞相容性树脂化学配方，使其在生物医学应用中具有显著优势。

基于上述前提，本研究开发了一种用于动态细胞培养的设备（BioFlowWellplate），采用DLP制造技术完成。该培养皿的底部使用了PEGDA 250树脂，因为它具有良好的细胞相容性，能够促进细胞的高效附着，并且在薄层打印时保持透明度，同时具备足够的机械强度。微流控结构则采用了基于TEGORad? 2800的树脂，以模拟传统PDMS设备的特性。已有研究表明，TEGORad? 2800能够支持细胞生长，并且不会引起任何基因毒性效应。此外，通过使用类似药物的溶液（如罗丹明6G）进行流体实验，发现TEGORad? 2800对药物的保留率远低于PDMS。最终，该设备的设计使其能够兼容标准的实验仪器，如微量板读数仪和倒置显微镜，从而便于后续的细胞分析。

动态培养的内皮模型被选为BioFlowWellplate的主要应用目标。内皮细胞是血管的主要成分，在人体组织中扮演着多重角色，尤其是在作为屏障和介导免疫反应中的细胞间相互作用方面。关于内皮屏障功能，它能够持续允许溶质和小分子通过，同时限制大分子和细胞的渗出，这得益于其特殊的细胞间连接结构（如桥粒、粘附连接和间隙连接）。因此，内皮细胞在药物输送中发挥着关键作用，既是重要的治疗靶点，也是药物到达血管壁外组织的屏障。本研究的主要目标是开发一种先进的设备，用于药物测试和治疗筛选，通过动态内皮模型实现更精确的模拟。

最后，该设备被用于3D细胞化支架的动态培养测试，即在不同基质中嵌入细胞的3D体外模型。一种有前景的生物墨水是甲基丙烯酸基胶原蛋白（GelMA），它是一种光交联水凝胶，广泛应用于多种细胞培养场景。总的来说，BioFlowWellplate具有高度的通用性，能够支持2D和3D细胞培养的动态过程，并且基于3D打印技术，可以根据不同实验需求进行定制和调整。

与现有的依赖摇摆驱动的振荡流动的动态微孔板相比，BioFlowWellplate提供了连续、单向的灌注方式，能够模拟生理剪切力和营养梯度。此外，与固定几何形状和材料的商业系统相比，该平台结合了光学透明性、细胞相容性和低药物吸收特性，并且具有标准的96孔格式。这种集成是通过vat多材料3D打印实现的，使得复杂的、多材料的结构能够被无缝制造，这在传统模具或单材料3D打印中是难以实现的。

在材料制备和3D打印方面，本研究采用了两种不同的树脂配方。PEGDA 250树脂用于制造底部结构，以确保细胞附着、透明性和机械稳定性。而TEGORad? 2800树脂则用于微流控结构，以模拟PDMS设备的特性。为了优化打印参数，研究者对两种树脂进行了不同的配方调整。例如，在PEGDA 250树脂中添加了0.1%的自由基捕获剂（PT）和1%的光引发剂（BAPO），以防止树脂在可见光下发生聚合反应。这些树脂被储存在暗色容器中，并通过超声波处理以确保均匀性。随后，利用DLP打印机（Asiga MAX）在405 nm光源下进行3D打印，设置每层厚度为50 μm，并且保持相同的光强（22.19 mW cm?2）。为了优化不同结构区域的曝光时间，研究者对各种结构进行了独立测试（见表S3）。打印完成后，设备进行了紫外线后固化处理（50 mW cm?2，持续5分钟），以完成交联过程。随后，设备被置于乙醇溶液中进行清洗，以去除可能释放的细胞毒性物质。清洗过程包括两次30分钟的乙醇浸泡和一次过夜浸泡，之后再将其置于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中过夜，并在生物安全柜中接受30分钟的紫外线灭菌处理。

为了评估3D打印设备的打印精度，研究者使用了3Shape E3三维扫描仪进行定量分析。该设备的设计充分考虑了兼容性，以匹配标准商用聚苯乙烯96孔板（Greiner Bio-One）的尺寸和孔间距，从而确保能够兼容常规的实验仪器（如板读数仪）。每个孔的直径为6.95 mm，高度为10 mm，孔间距为9 mm。设备分为三行，每行包含四个孔，每行之间通过微流控通道连接，以实现同一行内介质的共享流动，同时保持行与行之间的独立性。每个微流控通道的宽度和高度均为1 mm，入口和出口的直径为1 mm，便于连接外部泵系统。设备底部的厚度为1.30 mm，但在每个孔下方减少至0.30 mm，以增强光学透明度，便于显微镜观察。这种设计不仅支持并行的动态培养实验，还确保了设备能够兼容标准的分析仪器，同时允许每行独立使用不同的培养液储存器。

为了进一步优化微流控部分的性能，研究人员对微流控通道的几何形状进行了特殊设计。例如，入口和出口被定位在不同高度，以确保液体能够顺利填充和流动。此外，内部通道的直径大于入口和出口，以防止在打印过程中发生堵塞。这种几何设计不仅提高了清洗效率，还确保了在灌注过程中不会出现通道阻塞。在设备制造完成后，研究人员对设备进行了详细的流体模拟和实验测试，以评估其在不同流速下的性能。使用COMSOL Multiphysics 6.1软件进行流体模拟，将CAD模型导入作为输入几何体，并对模拟区域进行了简化，仅考虑其中一行的三个串联孔。通过利用通道在纵向方向上的对称性，研究人员进一步减少了模拟的复杂性。模拟结果显示，在不同的流速下，设备内部的流体压力、速度和位移分布情况。例如，最大速度出现在通道之间，而最大压力则集中在通道两端。此外，研究人员还分析了Von Mises应力和位移情况，以评估设备在高流速下的结构稳定性。结果显示，即使在最高流速（500 μl min?1）下，设备的最大应力仍远低于所用材料的极限抗拉强度（PEGDA 250为4.5 × 10? N m?2，TEGORad? 2800为0.7 × 10? N m?2），表明该设备在动态培养中具有良好的结构稳定性。

在实验测试中，研究人员使用了双头蠕动泵（LiveFlow，IVTech）进行流体灌注，并选择了与模拟相同的流速（如50 μl min?1、100 μl min?1等）。为了确保实验的无菌性，所有管道和储存器均在生物安全柜中进行灭菌处理。通过这些实验，研究人员验证了设备在不同流速下的流体流动特性，并观察到在较高流速下（如500 μl min?1）出现的湍流现象。此外，实验还表明，在较高流速下，孔内的液体高度可能发生变化，导致部分液体溢出。这一发现为后续的设备优化提供了重要依据，即需要改进微流控设计，以防止在高流速下发生液体溢出。

为了验证设备的细胞培养可行性，研究人员还进行了显微镜成像测试。通过使用A549-GFP+细胞（该细胞系表达绿色荧光蛋白，便于荧光显微镜观察），他们评估了设备在不同条件下的细胞附着效率和生长情况。实验结果显示，在24小时内，细胞的代谢活性约为对照组（商用聚苯乙烯板）的一半，这可能是由于新型材料在细胞培养中的初次适应性问题。然而，在72小时后，细胞的生长速率与对照组相当，表明该设备能够支持细胞的长期培养。此外，研究人员还通过不同倍率的显微镜（如4倍和10倍）对细胞的形态进行了详细观察，证实了设备在细胞培养和成像方面的可行性。虽然在4倍倍率下，设备的3D打印材料（PEGDA/TEGORad）显示出一定的自荧光背景，但在10倍倍率下，细胞的形态和分布能够清晰可见。

在细胞活性测试中，研究人员使用了LIVE/DEAD细胞检测试剂盒，以评估内皮细胞（EC）在BioFlowWellplate上的附着和存活情况。实验结果显示，EC在24小时内具有超过98%的活性，尽管细胞分布尚未完全均匀，主要集中在孔的边缘。这一现象可能与孔的几何形状和表面特性有关，因为静态条件下细胞的沉降和附着可能受到这些因素的影响。为了进一步研究这一现象，研究人员还进行了对照实验，将EC在标准的聚苯乙烯板上进行24小时培养。结果显示，对照组的细胞分布更加均匀，这表明3D打印设备的材料特性可能需要进一步优化，以促进细胞的均匀附着。动态培养条件下的流体流动可以改善营养输送和废物清除，从而减少细胞-材料界面的局部梯度，提高细胞的均匀分布。

此外，研究人员还测试了BioFlowWellplate在动态条件下对内皮细胞代谢活性的影响。实验结果表明，在动态培养条件下，细胞的代谢活性显著提高，从静态条件下的低于30%提升至接近对照组（商用聚苯乙烯板）的60%。这一结果表明，BioFlowWellplate在动态内皮模型的培养中具有巨大的潜力，能够用于研究内皮细胞与药物或治疗手段的相互作用。同时，该设备还支持对3D GelMA支架的动态灌注测试，进一步验证了其在复杂细胞培养系统中的应用前景。

在3D动态测试中，研究人员将GelMA支架倒入BioFlowWellplate的孔中，并通过注射针头制造出类似血管的腔道。随后，使用含有分散蓝的ddH?O溶液作为流动介质，模拟药物扩散过程。实验结果显示，在24小时内，培养液能够充分扩散，并从孔中溢出，这表明在没有内皮细胞的情况下，支架内部的介质流动可能存在一定的渗透性。因此，为了获得具有调控能力的内皮层，需要进一步对血管腔道进行内皮细胞接种。这些初步的3D灌注实验结合条件培养液分析，证明了BioFlowWellplate在3D细胞化支架动态培养中的可行性。未来的研究将探索在GelMA支架中植入内皮细胞和基质细胞，并在动态灌注条件下监测细胞的活性和增殖情况。

综上所述，BioFlowWellplate作为一种新型的双材料微流控培养皿，不仅能够实现动态细胞培养，还能够兼容多种实验仪器，支持细胞的长期生长和药物测试。其独特的设计结合了光学透明性、细胞相容性和低药物吸收特性，为研究人员提供了一种高度灵活和可定制的实验平台。此外，该设备的制造基于简单的增材制造方法，使用商用材料，这为其在广泛的应用领域提供了良好的前景。尽管目前的研究仍存在一些局限性，例如初始细胞附着效率较低以及高流速下的液体溢出问题，但通过进一步优化设备设计和材料表面处理，这些挑战有望得到解决。未来的研究将聚焦于提高细胞附着效率、优化微流控设计以避免液体溢出，并开发更复杂的3D体外模型，以更真实地模拟体内环境，从而推动药物测试和治疗研究的发展。