通过牺牲性微凝胶在骨芯片平台上构建破骨细胞吸收单元

《Lab on a Chip》：Engineering osteoclast resorption units via sacrificial microgels in a bone-on-chip platform

骨-芯片平台通过微流控技术生成骨多细胞单元（BMU）模拟的预定结构微腔，利用可降解微凝胶实现非侵入式监测破骨细胞活性。该平台克服传统模型的空间限制和成像障碍，通过酶解微凝胶形成可控腔体，结合反射共聚焦显微术定量评估破骨细胞介导的骨基质降解。研究证实该模型能有效反映RANKL刺激下破骨细胞活性增强现象，为骨重塑疾病建模和药物筛选提供新工具。

　　骨重塑是一个关键的生理过程，对于维持骨骼的结构和功能至关重要。这一过程主要由骨多细胞单位（BMU）内的多种细胞相互作用完成，其中破骨细胞在骨基质的降解中发挥核心作用。然而，传统的动物模型和常规的体外系统在再现人类BMU的空间结构和细胞复杂性方面存在显著局限。此外，由于骨组织具有矿化特性，其固有的不透明性给成像带来了挑战，限制了对破骨细胞活性的实时监测能力。因此，开发一种能够提供空间限制、可控降解以及对破骨细胞功能进行有效评估的体外模型，对于深入研究骨重塑机制和相关疾病具有重要意义。

在这一研究中，科学家们提出了一种受BMU启发的骨芯片平台，旨在实现对人类破骨细胞功能的局部、非侵入式分析。该平台利用微流控技术生成单分散、酶促降解的葡聚糖-酪胺（Dex–TA）微凝胶，并将其封装在矿化胶原水凝胶中。这些微凝胶在特定条件下被选择性降解，从而在芯片上形成具有细胞成分的受限微结构。这一设计不仅能够精确控制微结构的尺寸和形状，还为研究破骨细胞在矿化基质中的活动提供了理想的环境。此外，由于微腔与周围矿化基质之间的对比度，科学家们利用反射共聚焦显微镜实现了对基质降解过程的非破坏性监测，为破骨细胞的活动提供了直观的观察手段。

为了验证该平台的有效性，研究人员对破骨细胞的形态学和功能进行了免疫细胞化学分析。结果表明，破骨细胞在芯片上成功分化，并展现出典型的多核形态、较大的细胞质区域、肌动蛋白环和密封区的形成，以及CTSK（组织蛋白酶K）的表达。这些特征与体内BMU中的破骨细胞行为高度一致，表明该平台能够准确模拟破骨细胞的功能。此外，通过将破骨细胞暴露于RANKL（核因子κB受体激活剂配体）刺激，研究还观察到ORU体积的显著增加，进一步验证了该系统在评估破骨细胞活性方面的有效性。这一发现不仅揭示了RANKL对破骨细胞活动的促进作用，也表明该平台可用于模拟病理条件下的骨重塑过程，如骨质疏松症。

在方法学方面，研究人员采用了多种先进的技术手段。首先，通过微流控芯片的制造，构建了一个能够容纳细胞和流体的微环境。芯片由硅胶模具制造，使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为材料，其结构设计为包含一个中央细胞腔室和两个供流体流动的通道。这种设计使得细胞能够在模拟的骨微环境中进行生长和活动，同时避免了传统体外模型中缺乏空间限制的问题。其次，微凝胶的生成和表征是该研究的关键步骤之一。通过使用微流控滴注系统，研究人员成功制备了直径为161.8 ± 7 μm、壳厚度为8.95 ± 1.43 μm的单分散空心微凝胶。这些微凝胶在封装细胞后，通过酶促降解策略释放出细胞，形成受限的微结构，即“破骨细胞降解单位”（ORU）。这种策略不仅实现了对细胞活动的精准控制，还为后续的定量分析提供了基础。

为了评估ORU体积变化作为破骨细胞活性的指标，研究团队开发了一套自动化的图像分析流程。他们利用Ilastik工具包对ORU进行像素分类和分割，从而快速、准确地获取体积数据。这种方法相比传统的人工分割，不仅节省了时间，还减少了人为误差。通过这一技术，研究人员能够在实验的整个过程中对ORU体积进行非侵入式的动态监测，从而更全面地了解破骨细胞的活动模式。此外，为了进一步验证该模型的可靠性，研究团队还进行了扩散实验，测试了荧光分子在HA掺杂胶原水凝胶中的渗透情况。结果显示，即使在没有主动灌注的情况下，荧光分子也能在15分钟内迅速扩散，说明该系统能够有效支持细胞的营养供给和代谢物交换。

在结果分析方面，研究团队通过对比不同处理条件下的ORU体积变化，揭示了RANKL对破骨细胞活性的显著影响。实验表明，RANKL处理的ORU体积相较于对照组有明显增加，说明该平台能够有效模拟破骨细胞在生理条件下的降解行为。值得注意的是，不同供体来源的破骨细胞在RANKL刺激下的响应存在差异，这反映了人类破骨细胞活性的个体化特征。这些差异可能与供体的年龄、性别、生活方式等因素有关，提示未来的研究需要进一步探讨这些变量对破骨细胞功能的影响。此外，研究团队还观察到一些ORU体积出现负变化，这可能是由于胶原水凝胶在与细胞接触后发生收缩，或是在流体剪切力作用下发生形变。因此，未来的优化方向可能包括改进水凝胶的机械稳定性，以延长实验时间并提高模型的可靠性。

本研究的成果不仅为骨重塑的体外研究提供了新的工具，还为疾病建模和药物筛选提供了潜在的应用价值。传统的骨芯片模型往往难以准确模拟破骨细胞的活动，而本研究通过引入微凝胶作为牺牲模板，成功构建了一个能够精确控制微结构和细胞分布的系统。这种技术的创新在于，它能够在不破坏基质结构的前提下，实现对破骨细胞活动的动态监测，为研究骨代谢疾病提供了更贴近生理环境的模型。此外，该平台还具备高通量的特点，每块芯片可以容纳超过60个独立的ORU，这使得研究人员能够同时评估多个样本，提高实验效率。

在技术整合方面，该研究结合了微流控技术和骨芯片平台，实现了对骨重塑过程的精确模拟。通过将Dex–TA微凝胶嵌入矿化胶原水凝胶中，研究人员不仅再现了BMU的结构特征，还构建了一个具有生物相关性的微环境。这种微环境包含胶原蛋白、羟基磷灰石（HA）和纤连蛋白（vitronectin），这些成分共同提供了丰富的细胞粘附信号和矿化基质，有助于破骨细胞的极化和活性表达。同时，该平台支持多种生物化学刺激的引入，例如RANKL，从而能够模拟不同病理条件下的骨重塑过程。这种灵活性使得该系统不仅适用于基础研究，还可以扩展至药物筛选和疾病建模等应用领域。

此外，该研究还探讨了未来可能的改进方向。例如，为了进一步提高模型的生物相似性，研究团队计划在未来的实验中引入成骨细胞系和内皮细胞，以模拟BMU中更为复杂的细胞-细胞相互作用。这些细胞不仅能够与破骨细胞进行直接的信号交流，还可能通过分泌旁分泌因子（如RANKL）调节破骨细胞的活性。此外，血管生成是骨重塑过程中的重要组成部分，与破骨细胞的活动密切相关。因此，将血管网络整合到ORU模型中，可能有助于提高模型的生理相关性和临床转化潜力。

在数据处理方面，研究团队采用了一系列先进的图像分析技术，包括反射共聚焦显微镜和机器学习算法。这些技术的应用使得ORU体积的测量更加高效和准确，同时也减少了对细胞的干扰。通过比较初始和最终的ORU体积，研究人员能够直观地评估破骨细胞对基质的降解程度。这种方法的优势在于其非侵入性和高分辨率，能够在不破坏细胞和基质的情况下实现对骨重塑过程的动态监测。然而，研究团队也指出，这种技术的广泛应用需要进一步优化图像采集参数，以确保不同实验条件下数据的一致性。

总的来说，这项研究为骨重塑的体外研究开辟了新的途径。通过结合微流控技术和生物材料工程，研究人员成功构建了一个能够模拟人类BMU结构和功能的骨芯片模型。该模型不仅能够实现对破骨细胞活性的精确评估，还具备高通量和可扩展性，适用于大规模的药物筛选和疾病研究。此外，该平台为理解骨代谢疾病的发病机制提供了重要的工具，并可能成为未来个性化医学和精准医疗研究的重要组成部分。随着技术的进一步发展，这一模型有望在临床前研究中发挥更大作用，为骨质疏松症等疾病的治疗提供新的思路和方法。