观察了一种脂质化的胰高血糖素样肽1类似物的独特稳定纳米组装结构

《Soft Matter》：Observation of unique stable nano-assemblies of a lipidated glucagon-like peptide 1 analogue

研究显示，GLP-1-Am(17, γ-Glu-palm)在pH 7.0时形成均匀的囊泡/环状纳米结构，具有高α-螺旋含量，且该结构对温度敏感，37℃摇动下逐渐聚集成无定形颗粒，揭示了脂质化位置对自组装形态的关键影响。

　　在生物医学研究中，GLP-1（胰高血糖素样肽-1）及其衍生物一直是备受关注的治疗靶点。作为一种重要的肠促胰岛素激素，GLP-1在调节血糖水平、促进胰岛素分泌以及抑制食欲等方面展现出显著的药理作用，因此被广泛用于治疗2型糖尿病和肥胖症。然而，其天然形式在血液中的半衰期非常短，仅有约2分钟，这限制了其作为口服药物的潜力。为了解决这一问题，科学家们开发了多种策略来延长GLP-1的体内半衰期，其中脂化修饰（lipidation）被认为是一种有效的手段。通过将脂肪酸基团连接到GLP-1的特定位置，可以显著提高其在体内的稳定性，同时保留其生物活性。目前，脂化后的GLP-1衍生物如利拉鲁肽（liraglutide）和塞马格鲁肽（semaglutide）已被广泛应用于临床，成为治疗糖尿病和肥胖的重要药物。

尽管脂化修饰在提高GLP-1的药代动力学特性方面取得了显著成效，但其在溶液中的自组装行为也引发了研究者的兴趣。脂化后的GLP-1衍生物由于具有两亲性（amphiphilic）特性，容易形成各种类型的自组装结构，包括寡聚体（oligomers）、胶束（micelles）以及更复杂的纳米结构，如囊泡（vesicles）和环状结构（toroids）。这些自组装结构不仅影响药物的物理化学性质，还可能影响其在体内的释放行为和药效。因此，研究脂化GLP-1衍生物在不同条件下的自组装特性，对于优化其作为长效药物的配方设计具有重要意义。

在本研究中，科学家们关注了一种特殊的GLP-1脂化衍生物——GLP-1-Am(17, γ-Glu-palm)。该分子在结构上与市售的利拉鲁肽非常相似，唯一的区别在于脂化位点被前移了三个氨基酸残基，并且其C端被酰胺化（amidation）。这一细微的结构差异可能对自组装行为产生了显著影响。研究发现，GLP-1-Am(17, γ-Glu-palm)在接近中性pH（约7.0）的条件下能够迅速形成高度均匀的非共价纳米组装体，其形态包括囊泡和环状结构。这种自组装行为仅在非常狭窄的pH范围内发生，表明其形成过程对pH环境具有高度敏感性。

为了进一步分析这些纳米结构的特性，研究者采用了多种技术手段。首先，通过透射电子显微镜（TEM）和冷冻电镜（cryo-EM）对组装体进行了形态学观察。结果表明，这些纳米结构在接近pH 7.0时呈现为规则的球形或环形结构，具有一个中心空腔，其直径约为21纳米。这种结构的形成在其他脂化GLP-1衍生物中并未观察到，表明GLP-1-Am(17, γ-Glu-palm)在自组装行为上具有独特性。此外，研究者还利用尺寸排阻色谱（SEC）对组装体的尺寸分布进行了分析，结果显示在pH 7.0条件下，所有组装体的尺寸非常一致，表明其具有高度的均一性。

进一步的研究发现，这些纳米结构在37°C的条件下会随时间发生聚集行为。通过使用ANS（8-氨基-1-萘磺酸）和ThT（硫黄素T）荧光分析，研究者观察到两个不同的聚集阶段。在第一个阶段，初始的囊泡或环状结构逐渐转变为更大的空心结构；在第二个阶段，这些结构进一步聚集形成非晶态的β结构丰富的聚集体。这一过程伴随着荧光信号的变化，表明随着聚集的进行，纳米结构的表面疏水性逐渐增加，导致更多的ANS和ThT分子结合。此外，ThT荧光的逐渐增强也暗示了β结构的形成，这可能与药物的降解或活性变化有关。

这些自组装行为不仅揭示了GLP-1-Am(17, γ-Glu-palm)在溶液中的动态变化，还为开发新型长效药物提供了理论依据。由于这些纳米结构具有较高的α-螺旋含量，它们可能在体内以一种“类天然”结构与受体相互作用，从而实现缓慢释放的药效。这种自组装特性可能有助于药物在体内的稳定性和持久性，特别是在注射给药方式下，可以减少频繁给药的需要。此外，研究还发现，脂化位点的位置对自组装形态具有显著影响，这提示在设计GLP-1衍生物时，需要精确控制脂化位点的选择，以获得理想的自组装行为。

从更广泛的角度来看，GLP-1-Am(17, γ-Glu-palm)的自组装行为反映了脂化肽在不同环境下的复杂响应机制。这种响应不仅依赖于pH值的变化，还可能受到温度、离子强度以及缓冲液种类的影响。例如，研究中发现，当pH值超过7.0时，GLP-1-Am(17, γ-Glu-palm)的自组装行为发生变化，导致形成较小的非囊泡结构。这表明pH环境在调节自组装过程中的关键作用。此外，脂化位点的不同位置也会改变分子的自组装倾向，例如，GLP-1-Am(12, γ-Glu-palm)和GLP-1-Am(20, γ-Glu-palm)虽然具有相似的脂化和连接基团，但在相同条件下并未形成类似结构，进一步支持了脂化位点对自组装行为的决定性影响。

在实际应用中，这些自组装结构的稳定性对于药物的储存和递送至关重要。研究发现，GLP-1-Am(17, γ-Glu-palm)在pH 7.0条件下能够保持较高的结构稳定性，即使在37°C的环境中长时间培养，其自组装结构仍能维持一定的形态特征。然而，随着时间的推移，这些结构逐渐聚集，形成更大的非晶态聚集体，这一过程可能会影响其在体内的生物利用度和药效。因此，在开发基于GLP-1的药物时，需要充分考虑其自组装行为的动态变化，以确保药物在体内能够稳定释放并发挥预期的治疗效果。

此外，研究还揭示了自组装过程中可能存在的中间状态。通过荧光分析，研究者观察到在聚集过程中存在一个中间阶段，此时部分结构可能处于一种过渡状态，既不是初始的囊泡或环状结构，也不是最终的非晶态聚集体。这种中间状态的存在可能对药物的释放速率和作用机制产生重要影响，因此进一步研究其形成机制和结构特性对于优化药物设计具有重要意义。

总的来说，本研究为理解GLP-1脂化衍生物的自组装行为提供了新的视角。通过系统的实验和分析，研究者不仅揭示了GLP-1-Am(17, γ-Glu-palm)在特定条件下的自组装特性，还探讨了其在体内可能的药代动力学行为。这些发现不仅有助于进一步优化基于GLP-1的药物配方，还可能为其他具有自组装特性的肽和蛋白质药物的设计提供理论支持。未来的研究可以进一步探索这些自组装结构在不同生理条件下的稳定性，以及它们如何影响药物的生物活性和治疗效果。