在细胞周期进展受阻的细胞中，可以生产出组装好的AAV（腺相关病毒）衣壳

《Biotechnology and Bioengineering》：AAV Assembled Capsids Are Produced in Cells Blocked From Cell Cycle Progression

Adeno-associated virus (AAV) production efficiency is limited due to low yields and cell cycle synchronization issues. This study identified that only 10% of transfected HEK293 cells produce functional AAV capsids, with producer cells showing cell cycle arrest in G1/S phase and reduced expression of adenoviral helper genes E1A and E1B55K. RNA-seq analysis revealed upregulation of p53 pathway genes (TP73, SFN, CASP8) and downregulation of cell cycle促进基因 (MYC, CCND1, CCNB1), confirming a DNA damage response blocking cell proliferation while supporting AAV assembly. The results highlight cell cycle control and helper gene regulation as critical factors for AAV vector production.

　　在基因治疗领域，腺相关病毒（AAV）作为一种重要的载体，因其低免疫原性、广泛的组织亲和性和长期基因表达能力，被认为是实现体内基因治疗的理想工具。然而，AAV的生产过程仍然面临诸多挑战，尤其是在大规模生产时，其产量相较于其他生物治疗药物而言非常有限。目前，每名患者的AAV剂量通常介于10¹¹至10¹⁵个病毒基因组（vg）之间，这导致了生产过程中需要大量的培养体积，平均在10到30升之间。这种高需求直接导致了AAV的生产成本居高不下，限制了其在多种疾病治疗中的广泛应用。

研究发现，只有约10%的被AAV编码DNA转染的HEK293细胞能够成功组装出病毒衣壳。这一现象引发了一个重要的问题：为什么在成功转染的细胞中，仅有少数能够产生功能性的AAV？为了解决这一问题，研究人员对同一转染过程中产生的两个子群体进行了深入研究，一个是能够产生AAV衣壳的细胞，另一个是无法产生AAV衣壳的细胞。通过分析这两个子群体的细胞周期特征和分子通路差异，研究者发现，产生AAV的细胞在细胞周期进展上存在显著的阻滞，这一发现为提高AAV生产效率提供了新的视角。

AAV的生产通常依赖于HEK293细胞，这些细胞在转染后需要表达多种病毒基因，包括Rep蛋白和Cap蛋白，以及来自腺病毒的辅助基因。然而，当前的转染方法中，病毒蛋白编码序列和封装序列被分装在不同的质粒中，目的是避免产生具有复制能力的AAV病毒。这种设计虽然有效防止了潜在的病毒复制风险，但也可能影响病毒组装的效率。此外，转染过程中，遗传物质需要进入细胞核并按照特定的时间顺序进行复制和表达，但实际过程中，许多DNA在进入细胞核之前就可能被降解或无法有效传递。这导致了只有极小部分的转染DNA能够被成功利用，从而限制了AAV的产量。

在本研究中，研究人员利用流式细胞术和RNA测序技术，对不同子群体的基因表达模式进行了分析。他们发现，能够产生AAV的细胞表现出独特的细胞周期特征，如在G1/S期的阻滞。这种阻滞可能是由于AAV生产过程中细胞需要将更多的资源用于病毒衣壳的合成，而非正常的细胞分裂。此外，RNA测序结果显示，这些细胞在多个关键通路中表现出显著的基因表达变化，包括p53信号通路、细胞周期调控通路、溶酶体通路和过氧化物酶体通路等。这些通路的下调可能与细胞周期阻滞有关，同时也可能反映了细胞在应对病毒生产时的适应性反应。

与此同时，无法产生AAV的细胞群体则表现出不同的基因表达模式。例如，癌症相关通路和系统性红斑狼疮（SLE）通路在这些细胞中被显著上调。这表明，这些细胞可能在转染过程中经历了一种不同的细胞应激反应，可能是由于转染所引发的DNA进入过程或细胞内环境的改变。尽管这些细胞仍然能够表达部分病毒相关基因，但由于缺乏足够的衣壳蛋白，它们无法形成完整的病毒颗粒。因此，研究者推测，细胞周期阻滞可能是AAV生产的一个关键因素，而调控这一过程可能有助于提高AAV的产量。

为了进一步验证这一假设，研究人员在不同的时间点（如24小时和72小时）对细胞周期和基因表达进行了分析。结果表明，AAV生产细胞在72小时后仍然表现出显著的细胞周期阻滞，同时腺病毒辅助基因E1A和E1B55K的表达水平也有所下降。这一现象可能与细胞资源的重新分配有关，即细胞将更多能量用于病毒衣壳的合成，而非自身的分裂。此外，TGFB1信号通路的激活也被观察到，这可能与细胞周期阻滞有关，因为TGFB1在细胞周期调控中起着重要的作用。

值得注意的是，细胞周期阻滞并非所有转染细胞的普遍现象。非生产细胞群体虽然也经历了转染，但它们的细胞周期进展并未受到明显影响，这说明AAV生产与细胞周期阻滞之间存在某种特定的关联。通过分析不同细胞群体的基因表达变化，研究人员发现，生产细胞的基因表达模式与非生产细胞存在显著差异，尤其是在与细胞周期和DNA修复相关的通路中。这些差异可能为优化AAV生产提供了新的思路，例如通过调整转染条件或引入特定的调控因子，以促进更多细胞进入生产状态。

此外，研究还发现，细胞周期阻滞可能与AAV生产效率的提高有关。一些研究表明，细胞在进入G1/S期阻滞后，其核DNA含量增加，这可能有助于AAV基因组的复制和封装。因此，通过控制细胞周期，使细胞在特定阶段停留，可能有助于提高AAV的产量。然而，这种调控需要在不破坏细胞基本功能的前提下进行，以确保生产过程的稳定性和安全性。

综上所述，AAV的生产效率受到多种因素的影响，包括转染效率、细胞周期调控和基因表达模式。通过深入研究这些因素，研究人员希望能够找到提高AAV产量的方法，从而降低生产成本，使其在更广泛的临床应用中成为可行的治疗手段。未来的研究可能需要进一步探索如何优化转染条件，以及如何调控细胞周期，以实现更高效的AAV生产。这些努力不仅有助于推动基因治疗的发展，也可能为其他生物药物的生产提供新的思路和方法。