用于种子研究的生物传感器细胞系，能够再现阿尔茨海默病相关的tau蛋白结构折叠

《Journal of Biological Chemistry》：Seeding biosensor cell line that reproduces the Alzheimer tau fold

阿尔茨海默病tau蛋白种子特异性检测与结构分析

　　tau蛋白的异常聚集被认为是神经退行性疾病传播病理特征的关键因素，如阿尔茨海默病（AD）及其他tau蛋白病（tauopathies）。在这些疾病中，tau蛋白的异常折叠形成纤维状结构，这些结构可能通过“模板播种”机制在细胞间传播。为了研究这一过程，科学家们开发了多种生物传感器模型，这些模型能够检测并量化tau蛋白的播种聚集。然而，一些现有的生物传感器系统在结构再现性方面存在局限，它们无法完全复制某些tau蛋白病中的纤维结构。本研究描述了一种新的tau播种生物传感器模型，该模型基于HEK293T细胞，并且稳定过表达了一段包含HA标签的4R tau蛋白（K297-E391区域）。这种设计使得研究者能够更精确地检测由AD或其他tau蛋白病产生的种子纤维，同时保持对特定纤维结构的高灵敏度。

在研究中，科学家们首先利用病毒载体技术在HEK293T细胞中稳定表达了HA-tau297-391。通过西方印迹和免疫荧光分析，他们验证了这种过表达蛋白的表达情况，并观察到在添加了tau种子后，细胞内出现了大量不可溶的HA标记物质。这表明该生物传感器能够有效地响应由AD脑组织提取的tau种子，而对其他类型的tau蛋白病种子（如3R-only或4R-only）则反应较弱。进一步的实验显示，该系统对AD种子的检测灵敏度与之前报道的生物传感器相当甚至更高，这为研究tau蛋白病的传播机制提供了有力的工具。

为了深入理解播种后的结构变化，研究团队利用冷冻电镜（cryo-EM）对由AD种子诱导的tau纤维进行了结构分析。结果显示，这些纤维主要由两个具有阿尔茨海默纤维折叠结构的原纤维（protofilaments）组成，但它们的排列方式呈现为“头对头”的结构，这与之前在AD脑组织中观察到的纤维结构有所不同。这一发现表明，虽然该生物传感器能够准确地复制AD纤维的核心结构，但在某些方面可能与天然纤维存在差异，这些差异可能源于细胞类型、培养条件或所过表达的模板序列。因此，该系统在结构忠实性方面具有重要价值，同时为研究tau蛋白病的传播机制提供了新的视角。

研究还探讨了AD脑组织中tau纤维的种子能力。通过使用蔗糖梯度离心技术对AD脑组织提取的tau纤维进行分离，他们发现来自40%蔗糖梯度的纤维具有最强的种子能力。这表明在疾病进展过程中，不同脑区可能产生不同形式的tau纤维，而这些纤维在种子能力上存在显著差异。此外，研究团队还评估了不同处理方法对AD种子的灭活效果，发现5%次氯酸钠（NaOCl）是最有效的灭活方法，能够显著降低种子的活性，同时不影响细胞活力。这一发现为实验室操作中处理tau种子提供了安全的参考。

在实验方法上，研究团队详细描述了从AD脑组织中提取tau纤维的步骤，包括组织匀浆、离心、蔗糖梯度离心等。同时，他们也介绍了如何利用这些种子进行播种实验，包括细胞培养、转染、固定和染色等过程。通过自动化图像分析软件Fiji，他们能够高效地计数和量化细胞内的HA阳性聚集点，从而评估播种效果。此外，他们还进行了负染电子显微镜（TEM）和冷冻电镜（cryo-EM）分析，以观察tau纤维的形态和结构。

研究的结构分析部分揭示了HA-tau297-391在播种后的纤维结构与AD纤维之间的相似性和差异。例如，HA-tau297-391纤维主要由两个C形原纤维组成，但它们的排列方式与AD纤维不同，这可能与细胞内的环境有关。同时，研究还指出，在某些情况下，HA-tau297-391纤维可能无法完全形成成熟的PHF或SF结构，这可能是由于播种时间不够或细胞持续分裂等因素所致。这些发现为理解tau蛋白病的传播机制提供了新的线索。

本研究不仅开发了一种新型的tau播种生物传感器，还提供了关于AD种子的结构和功能的深入分析。这一成果有助于更准确地识别和量化tau蛋白病中的种子活性，并为未来的药物筛选和疾病机制研究提供了新的工具。此外，研究还强调了处理tau种子时的生物安全问题，提出了有效的灭活方法，以减少实验过程中可能的传播风险。这些研究结果为理解tau蛋白病的传播机制和开发新的诊断与治疗方法奠定了基础。