通过患者和工程突变体研究揭示的TRPML通道的离子选择性差异及其与疾病相关的功能障碍

《Journal of Biological Chemistry》：Differential ion selectivity and disease-associated dysfunction of TRPML channels revealed by patient and engineered mutants

该研究通过活细胞共聚焦成像技术，系统分析了TRPML1-3的亚细胞定位及Ca2?、Zn2?渗透性，发现TRPML1和TRPML3可双向通透，而TRPML2仅通透Ca2?。进一步研究患者来源的TRPML1突变体，发现F408Δ突变体具有部分离子渗透性和 constitutive Ca2?通透性，而其他突变体均严重丧失功能。通过结构导向突变，成功构建了选择性通透Ca2?但排斥Zn2?的TRPML1突变体I468V。该研究揭示了TRPML1突变体疾病严重程度与亚细胞定位及离子渗透性缺陷的关联性，为MLIV机制和靶向治疗提供了新工具。

　　TRPML（瞬时受体电位黏脂蛋白）通道是调控溶酶体运输、信号传导和功能的关键蛋白，它们在细胞内多种生理过程中发挥着重要作用。TRPML1、TRPML2和TRPML3是TRPML家族的三个主要成员，它们在结构和功能上具有一定的相似性，但也存在显著差异。这些通道主要分布在溶酶体和内体膜上，但它们的亚细胞定位和离子通透性并不完全一致，这可能与它们在不同细胞类型中的表达模式及功能特性有关。

TRPML1是与黏脂病IV型（MLIV）相关的基因，该病是一种影响中枢神经系统（CNS）的溶酶体储存障碍。MLIV的临床表现包括心理运动发育迟缓、发育迟滞和视网膜退化。尽管TRPML1的Ca2?信号传导功能已被广泛研究，但其在Zn2?运输中的作用却未被充分探讨。近年来，研究发现TRPML1在神经元中具有独特的Zn2?动员功能，这提示Zn2?信号在神经生理过程中可能具有特殊意义。此外，TRPML1的失活突变会导致溶酶体中Zn2?的积累，进而影响细胞功能。

TRPML2和TRPML3虽然在结构上与TRPML1相似，但它们的功能特性存在显著差异。TRPML2主要在免疫细胞中表达，其对Ca2?的通透性较强，但对Zn2?几乎没有通透性。TRPML3则主要分布在内质网（ER）和溶酶体膜上，其对Ca2?的通透性与TRPML1相似，但对Zn2?的通透性尚未被明确。这种差异可能与它们在不同细胞类型中的生理角色有关，例如TRPML2可能在免疫反应中发挥关键作用，而TRPML3可能在特定的细胞功能如听觉和色素生成中具有重要影响。

在本研究中，研究人员利用活细胞共聚焦显微镜技术，对TRPML1-3的亚细胞定位和离子通透性进行了全面分析。他们首先比较了TRPML1、TRPML2和TRPML3在HeLa细胞中的定位情况，发现TRPML1和TRPML2主要定位于溶酶体，而TRPML3则更倾向于定位于内质网。这一发现表明，TRPML3可能具有不同的调控机制，或其在不同细胞类型中表现出不同的定位特性。

接下来，研究人员分析了来自MLIV患者的十个TRPML1突变体的亚细胞定位情况。他们发现，部分突变体（如L106P、C166F、T232P、D362Y、R403C和V446L）表现出对内质网的偏好性定位，而其他突变体（如F408Δ、L447P、F465L和C463Y）则仍定位于溶酶体。这一结果提示，TRPML1突变可能影响其在细胞内的运输过程，导致其定位发生变化。此外，研究人员还发现，定位在溶酶体的非功能突变体往往与更严重的疾病表型相关，而定位在内质网的突变体则与较轻的表型相关，这可能与非功能TRPML1在溶酶体中的主导负效应或毒性作用有关。

在离子通透性方面，研究发现TRPML1和TRPML3都能通透Ca2?和Zn2?，而TRPML2仅通透Ca2?。这一发现有助于理解TRPML通道在不同细胞类型中的功能差异。为了进一步研究TRPML1对Zn2?和Ca2?的选择性通透性，研究人员设计了一种基于TRPML2序列同源性的TRPML1突变体，即I468V。该突变体在通透性测试中表现出对Ca2?的通透性，但对Zn2?几乎没有通透性，这为研究Zn2?和Ca2?在TRPML1介导过程中的不同生理作用提供了新的工具。

此外，研究还发现，F408Δ突变体是与较轻表型相关的一种TRPML1突变体，它保留了一定程度的离子通透性，并且能够在没有激动剂刺激的情况下表现出持续的Ca2?通透性。这表明，F408Δ突变体可能具有一定的功能残余，这或许有助于减轻疾病的严重程度。而其他大多数突变体则表现出严重的离子通透性丧失，与非功能状态一致，这进一步支持了TRPML1突变导致疾病发生机制的观点。

研究还揭示了TRPML1突变对细胞功能的影响。例如，TRPML1的突变可能导致溶酶体功能障碍，进而影响细胞内离子平衡。在某些情况下，非功能的TRPML1突变体可能通过干扰其他TRPML亚型的功能，产生主导负效应。这些结果提示，TRPML1突变体不仅影响其自身的功能，还可能通过与其他通道的相互作用影响整体的细胞功能。

在实验方法上，研究人员使用了多种技术手段，包括分子克隆、细胞转染、活细胞成像以及结构预测。他们通过将mCherry标签与TRPML1、TRPML2和TRPML3融合，利用共聚焦显微镜观察其在细胞内的定位情况。同时，他们使用了GZnP3和GCaMP5这两种基因编码的荧光探针，用于监测Zn2?和Ca2?的动态变化。通过这些方法，研究人员能够准确评估TRPML1突变体在不同条件下的离子通透性。

结构预测方面，研究人员利用AlphaFold 3预测了TRPML1 I468V突变体的结构。该突变体在TRPML1的开放状态下可能通过改变选择性过滤器的大小，影响Zn2?的通透性，而对Ca2?的通透性影响较小。这一发现不仅为理解TRPML1的功能提供了新的视角，也为未来开发选择性离子通道变体奠定了基础。

综上所述，本研究通过系统的实验分析，揭示了TRPML1、TRPML2和TRPML3在亚细胞定位和离子通透性方面的差异，以及这些差异如何影响MLIV的临床表现。此外，研究还成功构建了一种仅通透Ca2?而不通透Zn2?的TRPML1突变体，这为进一步研究Zn2?和Ca2?在TRPML1介导过程中的不同作用提供了重要工具。这些发现不仅有助于理解TRPML通道的功能机制，也为未来开发针对MLIV的治疗方法提供了新的思路。