大规模高通量筛选针对心脏瑞安尼丁受体的靶向治疗药物

《Journal of Biological Chemistry》：Large-scale high-throughput screen for cardiac ryanodine receptor targeted therapeutics

本研究通过荧光寿命（FLT）检测的FRET技术，对50,000化合物库进行高通量筛选，发现异噁唑类化合物可减少病理状态下泄漏的RyR2钙释放通道活性，提高细胞内钙动态平衡，为心脏和神经退行性疾病治疗提供潜在候选药物。分隔符：

　　在现代医学研究中，细胞内钙离子（Ca2?）的调控对于维持正常的心脏和神经功能至关重要。钙离子的异常释放是多种病理状态的核心特征，包括心律失常、心力衰竭、与年龄相关的神经退行性疾病等。本研究聚焦于通过高通量筛选（HTS）技术，寻找能够调节病理性钙释放通道——ryanodine受体（RyR）的化合物。这些化合物具有潜在的治疗价值，可以有效抑制或减少异常的钙泄漏，从而减轻相关疾病的发生和发展。

RyR是细胞内钙释放的关键通道，主要存在于内质网（ER）和其在肌肉细胞中的特化形式——肌浆网（SR）中。在哺乳动物中，存在三种RyR同工型，其中RyR2在心脏和大脑中表达最为广泛。在心脏中，RyR2是主要的钙释放通道，而在神经元中，它同样发挥重要作用。因此，对RyR2进行靶向干预，对于治疗心脑血管疾病和神经退行性疾病具有重要意义。本研究利用荧光共振能量转移（FRET）技术，结合荧光寿命（FLT）检测，构建了一种高通量的筛选平台，用于识别具有治疗潜力的RyR2调节剂。

研究团队使用了50,000种化合物的化学库，对RyR1和RyR2进行了筛选。这些化合物来源于一个专门针对中枢神经系统（CNS）药物开发的库，具备良好的血脑屏障穿透能力和安全特性。在筛选过程中，团队通过监测与RyR结合的辅助蛋白——钙调蛋白（CaM）以及一个已知能干扰RyR2域间相互作用的肽DPc10的结合情况，来评估化合物对RyR功能的影响。这一方法的建立基于一个重要的发现，即CaM与DPc10的结合在RyR2的病理状态中呈现负相关关系，而CaM的结合则更倾向于反映RyR2的正常状态。

为了提高筛选的准确性，团队在实验设计中考虑了多种因素，包括氧化应激的模拟条件。例如，在心脏SR的准备过程中，团队使用了过氧化氢（H?O?）来诱导病理状态，而在骨骼肌SR的准备中，则使用了氧化谷胱甘肽（GSSG）来模拟类似的条件。这些处理方法使得筛选结果能够更好地反映RyR在病理状态下的行为。此外，团队还通过使用不同的Ca2?浓度来模拟静息状态和收缩状态下的钙动态，从而全面评估化合物对RyR功能的影响。

通过这一筛选流程，团队共鉴定了603种能够显著改变FRET信号的化合物。这些化合物在后续的验证过程中，被进一步筛选为83种具有潜力的候选物。其中，10种化学骨架结构的化合物被优先选择，因为它们能够有效增强CaM与RyR2的结合，同时减少DPc10的结合。这表明这些化合物可能通过改变RyR的构象，从而抑制其异常的钙释放功能。为了进一步验证这些化合物的功能，团队使用了放射性配体结合实验（如[3H]ryanodine结合实验）来评估其对RyR2活动的影响。

研究发现，某些化合物能够显著降低RyR2的活性，而这些活性的降低与CaM结合的增强和DPc10结合的减少相一致。例如，isoxazole类化合物在多个实验中显示出良好的效果，能够增加ER中的钙负载，并在心脏细胞中提高钙瞬变的幅度。这一发现表明，isoxazole类化合物可能通过减少RyR2的钙泄漏，增强SR中的钙储存，从而改善心肌细胞的功能。值得注意的是，这些化合物并未影响L型钙通道（LTCC）或SERCA2a的功能，这说明它们的作用机制主要集中在RyR2本身，而非其他钙调节途径。

此外，研究团队还通过细胞实验进一步验证了这些化合物的作用。在T-Rex-293细胞系中，使用了表达人RyR2的稳定细胞株，并结合了ER钙传感器R-CEPIA1er，以监测钙动态变化。实验结果显示，isoxazole类化合物能够显著增加ER中的钙含量，特别是在那些初始ER钙含量较低的细胞中，这种效果更为明显。这表明这些化合物可能在具有高RyR2表达的细胞中发挥更大的作用，而在低表达的细胞中则效果较弱。

在心肌细胞实验中，团队观察到isoxazole类化合物能够增强AP诱导的钙瞬变幅度，并且对LTCC和SERCA2a的功能没有明显影响。这说明isoxazole类化合物的作用机制可能涉及减少RyR2的钙泄漏，从而增加SR中的钙储存，进而改善心肌收缩功能。这一结果为这些化合物在心力衰竭等心脏疾病的治疗潜力提供了有力支持。

值得注意的是，尽管许多化合物对RyR1和RyR2均具有调节作用，但团队并未找到对RyR2具有高度选择性的化合物。这可能意味着在后续的药物开发过程中，需要进一步筛选和优化，以获得更具特异性的RyR2调节剂。然而，这种缺乏选择性并不一定构成问题，因为通过进一步的结构活性关系（SAR）研究，可以开发出更具针对性的化合物。

在药物开发的背景下，这些化合物的化学结构和作用机制提供了重要的信息。例如，isoxazole环的引入可以改善化合物的理化性质，使其更易于穿透细胞膜，并可能具有更低的毒性。这种特性使其成为一种有潜力的药物骨架。同时，六氢喹啉-3-羧酰胺类化合物也表现出良好的效果，其作用机制可能涉及促进CaM结合，同时减少DPc10的结合。这些化合物的结构多样性为药物开发提供了丰富的选择。

此外，研究团队还对这些化合物的结构进行了深入分析，发现它们可能通过不同的方式影响RyR2的构象。例如，某些化合物可能通过增强CaM的结合来稳定RyR2的闭合状态，而另一些则可能通过减少DPc10的结合来实现这一目标。这些不同的作用机制可能在不同的病理条件下发挥不同的治疗效果，从而为个性化治疗策略提供基础。

研究结果表明，通过高通量筛选技术，可以有效地识别具有治疗潜力的RyR调节剂。这些化合物不仅能够减少钙泄漏，还能改善钙的动态平衡，从而对多种疾病产生积极影响。未来的研究方向可能包括进一步优化这些化合物的结构，以提高其选择性和效力，以及评估其在更广泛的组织和细胞类型中的作用。此外，还需要对这些化合物的药代动力学和毒性进行深入研究，以确保其在临床应用中的安全性。

综上所述，本研究通过创新的FRET技术，成功鉴定了多个具有治疗潜力的RyR2调节剂。这些化合物不仅在体外实验中表现出良好的效果，而且在细胞实验中也显示出对钙动态的积极调控作用。这些发现为未来的药物开发提供了重要的基础，并可能推动新的治疗方法在心力衰竭和神经退行性疾病的治疗中的应用。通过进一步的研究和优化，这些化合物有望成为治疗这些疾病的新型药物候选。