《Journal of Bioscience and Bioengineering》：One-pot synthesis of β-alanine from 1,3-diaminopropane using two-enzyme cascade in cell-free biotransformation
编辑推荐：
本研究开发了一种新型两酶级联无细胞生物转化策略，从1,3-二氨基丙烷（DAP）高效合成β-丙氨酸。通过优化酶活性（DAOAp）、反应条件（pH 9.0，37℃）及 Fed-batch 工艺，转化率提升至47%，产率达63 mg/L，突破了底物抑制限制。
Shanthi Shanmugasundaram | Anitha Janet Roshni Yesudhas | Andrea Kagoo | Ramalingam Subramanian
印度金奈安娜大学生物技术中心，邮编600025
我们开发了一种利用两种酶的级联反应从1,3-二氨基丙烷（DAP）一步合成β-丙氨酸的新方法。第一步中，DAP被二胺氧化酶（DAO）氧化为3-氨基丙醛（3-APAL）；第二步中，3-APAL被3-APAL脱氢酶（APALDH）氧化为β-丙氨酸。同时，过氧化氢酶（Catalase）和NADH氧化酶被用来降解副产物H?O?并再生辅因子NAD?。目前尚未在任何原核生物中发现专对DAP起作用的DAO。因此，我们最初使用商业化的真核生物DAO（来自猪肾）和过氧化氢酶（来自牛肝），以及分别来自Arthrobacter crystallopoietes和Lactococcus lactis的重组APALDH和NOX酶来验证这一概念。通过该途径成功合成了β-丙氨酸，41小时内产出了12.2 mM（1.1 g/L）的β-丙氨酸，转化率为12%。为了提高反应速率，我们从Arthrobacter pascens中筛选出了具有更高活性的DAO（DAOAp）。实验确定DAOAp的最佳pH值为9.0，最佳温度为37°C。批次酶转化实验中，转化率为6%，4小时内产出了0.33 mM（29 mg/L）的β-丙氨酸。批次转化效率较低的原因可能是底物对DAOAp、NOX和过氧化氢酶的抑制作用。通过连续进料批次转化实验克服了底物抑制问题，转化率达到47%，4小时内产出了2.34 mM（63 mg/L）的β-丙氨酸。连续进料批次转化使转化率提高了约7.5倍。这项研究实现了一种利用两种酶的级联反应从DAP一步合成β-丙氨酸的新方法。
化学试剂
- DAP购自东京化学实验室（日本东京）。
- 腐胺二盐酸盐、β-丙氨酸、过氧化氢酶、3-APAL二乙缩醛以及来自猪肾的DAO（DAOpk）购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
- β-NAD、β-NADH、培养基成分和缓冲液组分购自HiMedia Laboratories（印度塔内）。
- 高性能液相色谱（HPLC）级化学品购自Merck（印度孟买）。
- 本研究使用的其他化学品购自Sisco。
结果
本研究重点关注了提高β-丙氨酸产量的关键因素，包括筛选在适宜pH值、温度和缓冲条件下具有活性的高效酶；实现这些酶在重组大肠杆菌中的高表达；优化酶的浓度及其比例；以及研究不同底物、产物和副产物浓度下各酶的抑制作用。
讨论
本研究通过无细胞生物转化中的两酶级联反应实现了从DAP一步合成β-丙氨酸。证明了该过程用于β-丙氨酸生产的可行性。讨论了影响生产力的关键因素，如反应路径的热力学特性、酶的有效利用以及通过优化酶浓度和比例来防止中间产物的积累。此外，还探讨了实现高生产力所需的关键调控因素。
作者贡献声明
-
Shanthi Shanmugasundaram： 负责撰写初稿、方法学设计及概念构建。
-
Anitha Janet Roshni Yesudhas： 负责审阅和编辑文本及方法学部分。
-
Andrea Kagoo： 负责审阅和编辑文本及方法学部分。
-
Ramalingam Subramanian： 负责审阅和编辑文本、监督研究及概念构建。
数据获取
数据可应要求提供。
致谢
作者Shanthi Shanmugasundaram感谢安娜大学（Anna University）的百年研究奖学金（ACRF）计划以及印度科技部下属的妇女科学家计划（WOS-A）提供的研究支持。本研究得到了科技部妇女科学家计划（WOS-A，参考编号：DST/WOS-A/LS-251/2019）的资助。
