源自hMSCs的外泌体MIR17HG通过miR-372-3p/BCL6轴促进卵泡辅助T细胞的分化及骨肉瘤的进展

《Journal of Bone Oncology》：hMSCs-derived exosomal MIR17HG promotes follicular helper T cell differentiation and osteosarcoma progression via the miR-372-3p/BCL6 axis

外泌体来源的MIR17HG通过miR-372-3p/BCL6轴促进Tfh细胞分化和骨肉瘤增殖。

　　### 研究背景与意义

骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是一种对儿童和青少年健康构成严重威胁的恶性肿瘤，尤其在复发或转移的情况下，治疗选择极为有限。尽管近年来在OS的治疗方面取得了显著进展，但其整体生存率仍然较低，尤其是在面对耐药性或转移性病例时，治疗效果并不理想。目前，手术切除与化疗是OS的主要治疗方式，但这些方法在控制病情和改善预后方面仍面临诸多挑战。因此，探索新的治疗策略和分子机制对于提高OS患者的生存率和生活质量至关重要。

在肿瘤免疫调控中，细胞外囊泡（Exosomes）扮演着重要角色，它们可以携带非编码RNA、蛋白质和脂质等生物活性分子，参与肿瘤的生长、转移和免疫逃逸等过程。特别是来源于间充质干细胞（hMSCs）的外泌体，已被证实能够通过多种机制影响肿瘤的发展。例如，BMSCs来源的外泌体LCP1通过JAK2/STAT3信号通路促进OS的增殖和转移，而BMSCs来源的外泌体XIST则通过抑制miR-655的表达促进OS的生长。此外，OS来源的外泌体PD-L1通过抑制T细胞活性，推动肿瘤的进展。这些发现表明，外泌体在肿瘤免疫调节中具有重要作用。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，它们在免疫细胞的生长、分化和功能调控中发挥关键作用。例如，IL21-AS1在Tfh细胞中高度表达，并通过与hnRNPU结合促进Tfh细胞的分化。MIR17HG作为一种位于染色体13q31.3区域的lncRNA，已被证明参与细胞增殖、分化和凋亡的调控，其异常表达通常与多种恶性肿瘤的发生和发展相关。在OS中，MIR17HG已被报道通过SP1/MIR17HG/miR-130a-3p/SP1信号通路促进肿瘤进展。因此，研究MIR17HG是否通过特定的分子机制影响Tfh细胞的分化，进而推动OS的发展，具有重要的科学意义和临床价值。

本研究首次系统探讨了hMSCs来源的外泌体中MIR17HG如何通过miR-372-3p/BCL6信号通路影响Tfh细胞的分化、激活以及OS细胞的增殖。这些发现不仅揭示了OS进展的新机制，还为开发新的免疫治疗策略提供了理论依据和潜在靶点。

### 研究方法与技术路线

为了验证MIR17HG在OS进展中的作用，研究采用了多种实验方法和技术手段。首先，通过差速离心法提取hMSCs来源的外泌体，并利用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和Western blot技术对外泌体的形态学和表面标志物进行鉴定。这些技术帮助研究人员确认了外泌体的典型特征，如球形或椭圆形的形态、60-100 nm的直径，以及CD9、CD63和CD81等外泌体特异性标志物的高表达。

接下来，通过qRT-PCR和Western blot技术检测了MIR17HG在hMSCs和CD4+ T细胞中的表达水平。研究发现，MIR17HG在hMSCs来源的外泌体中显著上调，而通过过表达载体（oe-MIR17HG）的转染进一步提高了其表达。此外，研究还通过流式细胞术（Flow Cytometry）分析了CD4+ T细胞在与外泌体共培养后的分化和激活情况。结果显示，hMSCs来源的外泌体（尤其是MIR17HG过表达的外泌体）显著促进了Tfh细胞的分化和激活，同时增加了PD-1和BCL6的表达，这些分子被认为是Tfh细胞的关键标志物。

为了进一步探究MIR17HG对OS细胞增殖的影响，研究人员进行了共培养实验，将MIR17HG过表达的CD4+ T细胞与OS细胞系MG63共同培养。结果表明，hMSCs-Exo-MIR17HG显著提高了MG63细胞的存活率，并抑制了其凋亡。这些数据表明，MIR17HG可能通过影响Tfh细胞的分化和激活，进而促进OS细胞的增殖。

此外，为了验证MIR17HG与miR-372-3p之间的相互作用，研究采用了RNA免疫沉淀（RIP）技术。该技术证实了MIR17HG确实能够与miR-372-3p结合，这为后续的机制研究奠定了基础。进一步的双荧光素酶报告基因实验则表明，miR-372-3p能够靶向调控BCL6的表达，而BCL6的过表达可以部分或完全逆转miR-372-3p对Tfh细胞分化和OS细胞增殖的抑制作用。这些结果支持了MIR17HG通过miR-372-3p/BCL6信号通路调控Tfh细胞分化和OS进展的假设。

为了评估MIR17HG在体内的作用，研究构建了一个MG63来源的异种移植小鼠模型。结果显示，hMSCs-Exo-MIR17HG显著促进了肿瘤的生长和重量增加，而通过miR-372-3p的过表达，这种促进作用被部分逆转。同时，免疫组织化学（IHC）检测显示，hMSCs-Exo-MIR17HG处理后的肿瘤组织中Ki67的表达显著增加，Ki67是细胞增殖的标志物，进一步验证了其对OS细胞增殖的促进作用。

在统计分析方面，研究采用了GraphPad Prism 10.1.2和ImageJ软件进行数据处理。所有实验数据均以均值±标准差（mean ± SD）表示，使用Student's t-test进行两组之间的比较，使用单因素方差分析（ANOVA）进行多组之间的比较。统计学上显著的差异被定义为p值小于0.05。

### 研究结果与分析

通过一系列实验，研究发现hMSCs来源的外泌体中MIR17HG的表达显著上调，并且其过表达能够进一步增强外泌体对Tfh细胞分化和激活的促进作用。具体而言，流式细胞术分析显示，与PBS处理相比，hMSCs-Exo处理后CD4+ T细胞中Tfh细胞的比例显著增加，而hMSCs-Exo-MIR17HG处理组的Tfh细胞比例进一步升高。这表明，MIR17HG在hMSCs来源的外泌体中起着重要的作用，能够促进Tfh细胞的分化和激活。

同时，研究还发现，MIR17HG的过表达显著增加了CD4+ T细胞中PD-1和BCL6的表达水平。PD-1是T细胞激活的重要标志物，而BCL6是Tfh细胞分化的关键转录因子。这些结果进一步支持了MIR17HG通过调控PD-1和BCL6的表达来促进Tfh细胞分化和OS细胞增殖的假设。

在体外共培养实验中，hMSCs-Exo-MIR17HG处理的CD4+ T细胞与MG63细胞共同培养后，MG63细胞的存活率显著提高，而其凋亡率则明显下降。这一现象说明，Tfh细胞的分化和激活可能通过某种机制促进OS细胞的增殖和存活。

为了验证MIR17HG与miR-372-3p之间的相互作用，研究采用了RNA免疫沉淀技术。结果表明，MIR17HG确实能够与miR-372-3p结合，而miR-372-3p的过表达则显著抑制了PD-1和BCL6的表达，同时减弱了Tfh细胞的分化和激活。这表明，MIR17HG可能通过“海绵”作用（sponge effect）来调节miR-372-3p的表达，从而影响下游靶基因BCL6的表达水平。

此外，通过双荧光素酶报告基因实验，研究证实了miR-372-3p能够直接靶向BCL6的3′UTR区域，从而调控其表达。当miR-372-3p过表达时，BCL6的mRNA和蛋白表达水平显著下降，而BCL6的过表达则能够部分或完全逆转miR-372-3p对Tfh细胞分化和OS细胞增殖的抑制作用。这表明，BCL6是miR-372-3p的直接靶标，而MIR17HG可能通过结合miR-372-3p来间接调控BCL6的表达。

在体内实验中，研究构建了MG63来源的异种移植小鼠模型，并观察了hMSCs-Exo-MIR17HG对肿瘤生长的影响。结果显示，hMSCs-Exo-MIR17HG处理的小鼠肿瘤体积和重量显著增加，而miR-372-3p的过表达则部分逆转了这一现象。免疫组织化学检测进一步表明，hMSCs-Exo-MIR17HG处理后的肿瘤组织中Ki67的表达显著增加，表明其对OS细胞增殖的促进作用。

### 研究讨论与意义

本研究揭示了hMSCs来源的外泌体中MIR17HG如何通过miR-372-3p/BCL6信号通路促进Tfh细胞的分化和OS的进展。这一发现为理解OS的免疫调控机制提供了新的视角，并为开发基于外泌体的免疫治疗策略提供了理论依据。此外，研究还指出，MIR17HG可能通过“海绵”作用调控miR-372-3p的表达，从而影响下游靶基因BCL6的表达水平，进而调控Tfh细胞的分化和OS细胞的增殖。

然而，研究也指出了其局限性。首先，实验主要依赖于细胞系和异种移植模型，这些模型虽然便于研究肿瘤的生长和转移，但无法完全模拟体内复杂的骨微环境，可能影响研究结果的临床转化。其次，部分实验组的样本量较小，可能限制了统计分析的效力。此外，尽管研究发现了Tfh细胞的分化变化，但其对B细胞辅助功能和抗体类别转换的具体作用仍需进一步验证。

未来的研究方向包括使用原位模型（Orthotopic models）来更准确地模拟OS在体内的微环境，扩大临床样本规模以提高统计分析的可靠性，并通过更全面的Tfh功能实验来评估其在OS中的作用。这些研究将有助于更深入地理解MIR17HG在OS中的分子机制，并为开发新的免疫治疗策略提供理论支持。

### 研究结论

综上所述，本研究首次系统揭示了hMSCs来源的外泌体中MIR17HG如何通过miR-372-3p/BCL6信号通路促进Tfh细胞的分化和OS的进展。这一发现不仅加深了对OS免疫调控机制的理解，还为开发新的治疗策略提供了潜在靶点。通过体外和体内的实验验证，研究证实了MIR17HG在OS进展中的关键作用，并提出了其可能的调控机制。这些结果为未来的临床研究和治疗策略提供了重要的科学依据。