《Journal of Clinical Virology》：Development and evaluation of a novel RT-qPCR assay for detection of Crimean Congo haemorrhagic fever virus using the Genedrive? point-of-care platform.
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克里米亚-刚果出血热（CCHF）是一种致命性病毒性出血热，现有诊断依赖实验室RT-PCR检测，耗时长影响救治。本研究开发基于Genedrive便携式PCR平台的直接血清样本RT-qPCR检测方法，经临床样本验证，V1和V2版本的灵敏度分别为94.4%和92.3%，特异性达97.6%和100%。该方法可缩短诊断时间至数小时，符合WHO对现场快速诊断设备的要求，为CCHF防控提供新工具。
安娜·I·库巴斯·阿蒂恩扎尔（Ana I. Cubas Atienzar）|克里斯托弗·T·威廉姆斯（Christopher T. Williams）|亚瑟敏·科斯冈（Yasemin Cosgun）|法特玛·贡贾·阿尔斯兰（Fatma Gonca Arslan）|哈坎·赫德菲（Hakan Hedef）|伊尔卡伊·博兹库尔特（Ilkay Bozkurt）|凯文·S·理查兹（Kevin S. Richards）|西恩·萨默斯（Sian Summers）|詹姆斯·皮特曼（James Pitman）|肖恩·安斯沃思（Shaun Ainsworth）|吉诺·米莱（Gino Miele）|克里斯蒂娜·莱吉奥（Cristina Leggio）|威廉·尼古拉斯（William Nicholas）|希拉里·鲍尔（Hilary Bower）|本尼迪克特·甘农（Benedict Gannon）|汤姆·E·弗莱彻（Tom E. Fletcher）|古莱·科鲁克卢奥卢（Gulay Korukluoglu）|托马斯·爱德华兹（Thomas Edwards）
英国利物浦热带医学院药物与诊断中心（Centre for Drugs and Diagnostics, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK）
摘要
引言
克里米亚-刚果出血热（Crimean-Congo haemorrhagic fever，CCHF）是一种病毒性出血热，由于缺乏有效的应对措施，被世界卫生组织列为优先关注疾病。目前尚无可用于快速检测阳性病例的即时检测（POC）诊断工具，而这对于加快患者救治流程至关重要。
方法
我们开发了一种基于RT-qPCR的检测方法，该方法可与市售的Genedrive? PCR平台配合使用，能够在最少样本准备的情况下实现血清中病毒的检测。该检测方法的灵敏度和特异性通过对比RealStar? CCHFV RT-qPCR试剂盒（Altona Diagnostics，德国）进行了评估。
结果
在V1版本检测中（样本量n=150），灵敏度和特异性分别为94.4%（95%置信区间，88.2-97.9）和97.6%（95%置信区间，87.1-99.9）；在V2版本检测中（样本量n=55），灵敏度为92.3%（95%置信区间，74.9-99.5），特异性为100%（95%置信区间，87.7-100%）。
结论
本研究证明了使用即时检测RT-qPCR平台诊断CCHF的可行性，该方法有望缩短检测时间，从而改善临床管理效果。
引言
克里米亚-刚果出血热（CCHF）是一种由克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）引起的严重病毒性人畜共患病。据估计，每年约有15,000例病例[1]，死亡率在10%-40%之间[2]，在疫情爆发期间这一比例可上升至60%-80%[1,3]。人类主要通过感染了该病毒的Hyalomma蜱虫叮咬，或接触受感染的人类和动物血液及组织而感染，医护人员和屠宰场工人尤其处于高风险之中[4]。CCHF是分布最广的蜱传疾病，已在亚洲、非洲和欧洲的30多个国家报告病例[5]。过去十年中，由于蜱虫媒介的扩散、动物贸易的增加以及人类活动的频繁流动等因素，该疾病的爆发频率和新的感染区域不断增多[6,7,8]。
CCHF的诊断通常在中央参考实验室通过RT-qPCR技术进行，结果需要2-5天才能得出[9,10,11]。这种诊断延迟会影响患者的治疗和隔离，导致临床治疗效果不佳，并可能增加人际传播的风险[9,10,11]。
CCHF于2002年首次在土耳其被发现，目前该国每年报告的病例数已超过1000例，是全球病例最多的国家[12]。土耳其最大的四个CCHF参考实验室之一是安卡拉的卫生部（MoH）虫媒病毒实验室，每年接收来自56个城市的超过1000份疑似样本。
世界卫生组织（WHO）已将CCHF列为优先关注疾病，并认为开发即时检测（POC）和近患者诊断工具迫在眉睫[13]。
我们利用市售的便携式PCR平台Genedrive?（Genedrive Ltd，英国）开发了一种直接从血清中检测CCHFV的RT-qPCR方法。WHO针对CCHF诊断的推荐产品规格（TPP）要求使用封闭式的一次性检测盒，并使用冻干试剂以避免对冷链的需求，而Genedrive?正好满足这些要求。
部分内容摘要
伦理批准
在英国健康安全局（UKHSA）检测的血清样本以及在利物浦热带医学院（LSTM）检测的灭活血清样本均来自2015年在土耳其托卡特（Tokat）和萨姆松（Samsun）收集的疑似CCHF病例的剩余样本[15]。伦理批准分别由英国国防研究与伦理委员会（MoDREC）[571]和土耳其萨姆松的Ondokus Mayis大学伦理委员会（OMU KAEK 739）授予。在安卡拉卫生部检测的血清样本也是来自CCHF病例的剩余样本。
CCHFV检测方法的优化
目标1（试管1）包含V1版本和更新版本的探针，因此可以生成两条熔解曲线：在Quantstudio 5设备上，目标1的熔解曲线出现在58°C和63°C；在Genedrive设备上，目标1的熔解曲线出现在64°C和69°C，目标2的熔解曲线出现在59°C，内参（IPC）的熔解曲线出现在61°C。
该检测方法未在非目标微生物（n=XX）中检测到任何非特异性扩增现象。
讨论
我们基于Genedrive?平台开发了一种用于检测血清样本中CCHFV病毒RNA的方法，并使用来自土耳其CCHF患者的临床样本进行了验证。利用即时检测便携平台开发RT-qPCR检测方法是WHO研发计划的目标之一，最终设计的检测方法具有较高的灵敏度和特异性，与参考的CE认证RT-qPCR测试结果高度一致。
Genedrive?是一种手持式快速热循环仪，重量低于0.5公斤。
CRediT作者贡献声明
托马斯·爱德华兹（Thomas Edwards）：负责撰写、审稿与编辑、原始稿撰写、项目监督、方法学设计、资金获取及概念构思。本尼迪克特·甘农（Benedict Gannon）：负责项目监督及资金获取。希拉里·鲍尔（Hilary Bower）：负责项目监督及资金获取。古莱·科鲁克卢奥卢（Gulay Korukluoglu）：负责资金获取及概念构思。汤姆·E·弗莱彻（Tom E. Fletcher）：负责撰写、审稿与编辑、项目监督、方法学设计及资金获取。吉诺·米莱（Gino Miele）：负责项目监督及方法学设计。肖恩·安斯沃思（Shaun Ainsworth）：负责方法学设计。
利益冲突声明
肖恩·安斯沃思（Shaun Ainsworth）和吉诺·米莱（Gino Miele）是Genedrive公司的员工。Genedrive公司未参与实验设计或发表决策过程。其他所有作者均声明无利益冲突。
