靶向UHRF1的小分子化合物H93通过促进蛋白二聚化治疗前列腺癌的机制研究

《Communications Chemistry》：A Hybrid compound H93 treats prostate cancer by directly binding UHRF1 and promoting protein dimerization

本研究针对去势抵抗性前列腺癌(CRPC)治疗耐药性难题，开发了一种新型杂合小分子化合物H93。该化合物通过直接结合表观遗传调控因子UHRF1的SRA结构域，诱导其形成二聚体构象，破坏UHRF1-DNMT1相互作用，降低全基因组DNA甲基化水平，重新激活肿瘤抑制基因表达。体内实验证实H93能显著抑制肿瘤生长且无明显毒性，为UHRF1过表达癌症提供了新的治疗策略。

　　

前列腺癌是全球男性发病率第二的恶性肿瘤，而去势抵抗性前列腺癌(CRPC)更是临床治疗的主要挑战。虽然阿比特龙和恩杂鲁胺等二代抗雄激素药物已应用于转移性CRPC的治疗，但患者通常在用药6个月后产生耐药性。表观遗传调控异常在前列腺癌发生发展中扮演关键角色，其中UHRF1（包含PHD和RING指结构域的泛素样蛋白1）作为连接DNA甲基化和组蛋白修饰的核心桥梁，在前列腺癌组织中频繁过表达，且其表达水平与恶性程度呈正相关。尤其值得注意的是，UHRF1在耐药前列腺癌中呈现显著高表达，这使其成为极具潜力的治疗靶点。

尽管已有研究报道某些天然产物来源的小分子可诱导UHRF1蛋白降解，但迄今为止尚无UHRF1靶向药物进入临床试验。先前发现的先导化合物NSC232003虽能抑制UHRF1与DNMT1的相互作用，但抗癌活性较弱。这促使研究人员寻求新的药物设计策略来突破这一瓶颈。

在这项发表于《Communications Chemistry》的研究中，科研团队创新性地采用多靶点药物设计策略，将NSC232003的嘧啶环结构与伏立诺他的疏水尾部和Zn²⁺螯合羟肟酸基团进行整合，开发出新型杂合小分子化合物H93。研究人员通过系统的实验验证了H93的抗癌活性及其作用机制，为前列腺癌治疗提供了新的思路。

本研究主要采用以下关键技术方法：通过等温滴定量热法(ITC)测定结合亲和力；利用X射线晶体学解析复合物结构；采用免疫共沉淀(Co-IP)和双分子荧光互补(BiFC)技术验证蛋白相互作用；通过DNA斑点杂交和ELISA检测DNA甲基化水平；使用异种移植瘤模型评估体内药效；并应用免疫组化(IHC)和TUNEL染色分析肿瘤组织病理变化。

H93抑制前列腺癌细胞的体外增殖

研究人员通过集落形成实验和CCK-8 assay检测H93对前列腺癌细胞系的影响，发现其半数抑制浓度(IC₅₀)与UHRF1蛋白表达水平呈负相关。值得注意的是，H93对正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的活力无显著影响，显示出良好的肿瘤特异性。

H93直接结合UHRF1^SRA并与UHRF1^SRA二聚体形成复合物

ITC实验显示H93与UHRF1^SRA具有较强的结合亲和力，解离常数(K_d)为0.44±0.04μM。共结晶结构分析意外发现两个UHRF1^SRA分子形成二聚体界面，产生一个约1200?²的结合口袋，H93分子被包裹其中。关键残基Trp527、Arg528和Arg581参与相互作用，突变这些位点会显著降低结合亲和力。

SRA并与UHRF1^SRA二聚体形成复合物'>

H93促进UHRF1^SRA二聚化并破坏UHRF1-DNMT1相互作用

GST pull-down实验证实H93显著增强UHRF1^SRA二聚化。细胞水平实验通过Co-IP和BiFC进一步验证H93能促进全长UHRF1二聚体形成，同时以剂量依赖方式破坏UHRF1与DNMT1的相互作用。重要的是，当UHRF1的W527、R528和R581位点发生突变后，H93对UHRF1-DNMT1相互作用的抑制效果消失。

SRA体外二聚化并破坏UHRF1和DNMT1的蛋白结合'>

H93降低全局DNA甲基化水平

DNA斑点杂交和ELISA实验结果显示，H93以剂量依赖方式显著降低DU145和VCaP细胞的全基因组DNA甲基化水平。实时定量PCR(RT-qPCR)分析表明，H93能上调UHRF1调控的肿瘤抑制基因（如BRCA1、RUNX3、CDH1和CDKN1A）的mRNA表达。

H93抑制前列腺癌异种移植瘤的体内生长

在DU145细胞诱导的裸鼠皮下移植瘤模型中，每日灌胃给予50mg/kg和100mg/kg的H93可显著抑制肿瘤生长，且对小鼠体重无影响，显示出良好的安全性。免疫组化显示Ki67表达降低，TUNEL染色显示凋亡细胞增加，进一步证实了H93的体内抗肿瘤效果。

本研究首次揭示了一种通过稳定UHRF1二聚化来调控其功能的新机制。H93诱导的UHRF1二聚体可能采取"闭合"构象，阻碍了DNMT1的招募，从而破坏DNA甲基化维持。这种作用模式与近期报道的几种小分子调控蛋白构象的机制相似，如PD-L1同源二聚化抑制剂和Max-Max同源二聚体稳定剂。此外，作为多靶点分子，H93还能抑制HDAC1和HDAC6的去乙酰化活性，这可能与其抗肿瘤效应协同作用。

该研究的创新点在于发现了UHRF1二聚化这一先前未被重视的调控机制，并成功开发了首个能促进UHRF1二聚化的小分子化合物。H93与现有前列腺癌治疗药物（如恩杂鲁胺或奥拉帕利）联用表现出协同抗癌效应，为其临床转化提供了有力支持。这项研究不仅为前列腺癌治疗提供了新的候选药物，也为非激酶类靶点的药物开发提供了新的思路，特别是通过调控蛋白构象来增强靶点成药性的策略，对未来表观遗传药物的研发具有重要启示意义。