基于转录组学、人工神经网络以及Chou-Talalay分析的方法，探讨芪林丸在治疗卵巢储备功能下降方面的潜在机制及其活性成分

《Journal of Ethnopharmacology》：Transcriptomic, artificial neural network and Chou-Talalay analysis based investigation of potential mechanism and active components of Qi-Lin pill in treating diminished ovarian reserve

琪淋丸通过激活FSHR/ADCY1/cAMP/PKA/CREB通路改善卵巢储备减少，结合多组学分析和机器学习筛选出10种活性成分，并证实其协同增效作用。

　　Qi-Lin pill (QLP) 是一种源自唐代名方“五子衍宗丸”的传统中药方剂，常用于补肾益精、治疗不孕症和月经紊乱。然而，尽管其在临床中被广泛使用，但其治疗卵巢储备减少（Diminished Ovarian Reserve, DOR）的具体机制和有效成分仍然不清楚。为了揭示 QLP 的作用机制和有效成分，本研究整合了转录组学、人工神经网络（Artificial Neural Network, ANN）和 Chou-Talalay 分析等方法，从多个层面系统地探讨了其对 DOR 的影响。

DOR 是一种以卵子数量和质量下降、颗粒细胞功能受损为特征的卵巢疾病，导致生育能力下降和激素缺乏。其发病机制与异常卵泡发育密切相关，其中卵泡闭锁是关键的病理特征。颗粒细胞作为卵泡发育和成熟的核心功能单位，直接调控卵泡的命运，包括通过调节雌激素（E2）的生成、激素受体的表达以及其他旁分泌因子来影响卵泡的生长和发育。特别是，促卵泡激素（FSH）与促卵泡激素受体（FSHR）结合后，会激活细胞色素 P450 雄激素合成酶（aromatase）的表达，使雄激素转化为雌激素，这一过程对卵泡发育至关重要。同时，抗穆勒氏管激素（AMH）调节原始卵泡募集和优势卵泡选择，而颗粒细胞凋亡则显著影响卵泡闭锁和 DOR 的进展。尽管已有这些研究，如何通过多组分药物系统性地恢复颗粒细胞功能和卵巢储备仍不完全明确。

在中医体系中，DOR 的治疗有悠久的历史，常通过整体调节卵巢功能和同步卵泡与子宫内膜的发育来实现。QLP 作为传统中药方剂，保留了“五子衍宗丸”中的主要药材，如枸杞子（Lycium chinense Mill.）、菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）和覆盆子（Rubus idaeus Linn.），以增强补肾益精的效果，同时加入了其他中药成分以优化其治疗不孕症的疗效。近年来，中国多中心的临床研究证实，QLP 可以提高 DOR 患者的血清 E2 和 AMH 水平，降低 FSH 水平，从而改善月经周期和闭经症状。QLP 由十五种传统中药材组成，包括黄芪（Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.）、青皮（Citrus reticulata Blanco.）、菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）、党参（Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.）、姜黄（Curcuma aromatica Salisb.）、肉苁蓉（Cynomorium songaricum Rupr.）、山药（Dioscorea oppositifolia L.）、二叶草（Herba Ecliptae Eclipta prostrata L.）、淫羊藿叶（Epimedium brevicornu Maxim.）、枸杞子（Lycium chinense Mill.）、桑葚（Morus alba L.）、覆盆子（Rubus idaeus Linn.）、白芍（Paeonia lactiflora Pall.）、何首乌（Polygonum multijiorum Thunb.）和丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge.）等。这些药材的名称均参考了《The Plant List》和《中华人民共和国药典（2020年版）》。

QLP 的药效成分复杂多样，且不同成分之间存在相互作用。其治疗效果通常是多种成分协同作用的结果。因此，研究 QLP 的有效成分不能仅依赖于单一成分的作用，而需要系统性地分析其整体作用机制。人工神经网络（ANN）因其高度非线性的映射能力和良好的容错性，能够将中药方剂的复杂成分与生物效应联系起来，从而揭示潜在的有效成分。此外，Chou-Talalay 方法通过组合指数（Combination Index, CI）反映两种药物之间的拮抗（CI>1）、加成（CI=1）和协同（CI<1）作用，有助于评估 QLP 中各成分的协同效应。

本研究的目标是通过以下五个步骤，系统性地揭示 QLP 的作用机制和有效成分：（1）评估 QLP 对 CDDP 诱导的 DOR 小鼠的治疗效果，以确认其药效；（2）进行卵巢转录组学分析，以发现 QLP 在治疗 DOR 中的可能机制；（3）通过抑制和 siRNA 转染分析关键信号通路的表达，以验证 QLP 的药效机制；（4）利用 ANN 结合特征重要性分析，将 QLP 的化学成分与药效指标相关联，筛选出潜在的有效成分；（5）通过 Chou-Talalay 组合指数分析，评估潜在有效成分在关键靶点和药效指标中的协同作用。本研究旨在为传统中药方剂中筛选生物活性成分和揭示其协同作用提供新的方法和思路。

在实验过程中，首先将 QLP 口服给予 CDDP 诱导的 DOR 小鼠模型，观察卵巢指数、动情周期、卵巢组织形态和生化参数，以评估其治疗效果。结果表明，QLP 能够恢复动情周期，提高卵巢指数、血清激素（促卵泡激素、抗穆勒氏管激素、E2）水平以及卵泡发育（包括卵泡和黄体）。机制上，QLP 通过上调 FSHR 表达并激活 ADCY1/cAMP/PKA/CREB 信号通路，改善 CDDP 诱导的卵巢功能损伤，从而提高芳香化酶的表达和 E2 的合成。随后，通过 UPLC-QQQ-MS 技术，量化了 QLP 中的 33 种化合物，并结合 ANN 和特征重要性分析，筛选出十个潜在的有效成分，包括白芍中的 paeoniflorin 和 albiflorin，丹参中的 danshensu，没食子酸，以及黄酮类化合物如 hesperidin、nobiletin 和 epimedin C。最终，通过 Chou-Talalay 分析，评估了这些成分在关键靶点和药效指标中的协同作用，发现其中两种混合形式能够协同增强 FSHR 表达和 cAMP/PKA/CREB 信号通路，从而提高 E2 和芳香化酶的活性。

研究结果表明，QLP 通过多组分协同作用，激活 cAMP 介导的类固醇生成，从而改善卵巢功能。这一发现不仅为 QLP 的治疗机制提供了新的见解，也为传统中药方剂的现代研究提供了重要的参考。此外，本研究通过整合多种分析方法，为中药方剂中有效成分的筛选和协同作用的评估提供了系统的框架，有助于推动中药在生殖医学中的应用和发展。

QLP 的研究不仅有助于理解传统中药方剂的复杂作用机制，也为现代医学提供了新的治疗思路。通过系统性地分析其有效成分和作用靶点，可以更好地揭示中药在治疗 DOR 中的科学基础。此外，本研究的成果可能对开发新的中药制剂或优化现有中药治疗方案具有重要意义。随着对中药方剂研究的深入，未来有望进一步探索其在其他生殖疾病中的应用潜力，从而为不孕症和月经紊乱的治疗提供更多的选择。

在实际应用中，QLP 的治疗效果可能受到多种因素的影响，包括药材的质量、配方的配伍、剂量以及个体差异等。因此，进一步研究 QLP 的有效成分和作用机制，不仅有助于提高其临床疗效，也为中药的标准化和现代化提供了基础。此外，随着人工智能技术的发展，ANN 在中药研究中的应用前景广阔，能够更高效地筛选有效成分并预测其作用机制。这将有助于推动中药在精准医学和个性化治疗中的应用，提高治疗效果并减少副作用。

本研究通过多维度的方法，揭示了 QLP 在治疗 DOR 中的作用机制和有效成分，为传统中药方剂的现代研究提供了重要的参考。同时，研究结果也为中药在生殖医学中的应用提供了新的思路，有助于开发更有效的治疗方案。未来的研究可以进一步探索 QLP 在其他生殖疾病中的应用潜力，以及其与其他药物的协同作用，从而为不孕症和月经紊乱的治疗提供更多选择。此外，随着对中药成分研究的深入，有望进一步揭示其在不同疾病中的作用机制，推动中药在现代医学中的应用和发展。

QLP 的研究不仅具有重要的科学意义，也具有广泛的应用价值。通过系统性地分析其有效成分和作用机制，可以更好地理解中药在治疗 DOR 中的科学基础，为中药的现代化和国际化提供支持。此外，本研究的方法也为其他中药方剂的研究提供了借鉴，有助于推动中药在更多领域的应用。随着对中药方剂研究的深入，未来有望进一步探索其在不同疾病中的作用机制，推动中药在精准医学和个性化治疗中的应用，提高治疗效果并减少副作用。

总之，QLP 作为一种传统中药方剂，在治疗 DOR 中具有重要的应用价值。通过整合多种分析方法，本研究揭示了其作用机制和有效成分，为中药的现代研究提供了新的思路和方法。未来的研究可以进一步探索 QLP 在其他生殖疾病中的应用潜力，以及其与其他药物的协同作用，从而为不孕症和月经紊乱的治疗提供更多选择。同时，随着对中药成分研究的深入，有望进一步揭示其在不同疾病中的作用机制，推动中药在精准医学和个性化治疗中的应用，提高治疗效果并减少副作用。