一种用于分析完整类固醇结合物的定量、多组学LC-MS/MS方法：这是一种用于皮质类固醇依赖性疾病生物标志物研究的新型类固醇分析方法

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：A quantitative, broad-panel LC-MS/MS method for the analysis of intact steroid conjugates: a novel approach to steroid profiling for biomarker research in corticoid-dependent diseases

本研究开发了高效液相色谱-串联质谱法，无需酶解即可定量分析尿液中22种完整甾体代谢物（如硫酸盐、葡萄糖醛酸酯），验证其符合国际标准，并发现17-羟基孕烯醇酮硫酸盐等6种代谢物在肾上腺癌（ACC）患者中显著高于腺瘤（ACA）患者（p<0.001）。该方法为肾上腺肿瘤早期诊断和代谢机制研究提供了新工具。

　　在内分泌肿瘤学领域，激素的合成与代谢变化对疾病的发生和进展起着关键作用。因此，类固醇代谢可能成为肾上腺肿瘤的病理生理学因素之一，而类固醇的代谢产物则可能是临床诊断中极具挑战性的肾上腺皮质腺瘤（ACA）与罕见、侵袭性强的肾上腺皮质癌（ACC）之间鉴别诊断的生物标志物候选物。对人类生物样本中类固醇化合物的分析最准确的方式是基于质谱的分析方法。通常情况下，为了简化流程，代谢产物如硫酸盐和葡萄糖醛酸盐会在测量前被水解。因此，目前关于人体中实际类固醇结合物浓度的数据仍然十分有限。

本研究中，我们提出了一种紧凑的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，能够对尿液和血浆中22种完整的类固醇结合物进行绝对定量分析，整个仪器运行时间为11分钟，同时具备简单的样品制备流程。该方法根据国际公认的指南进行了成功验证，并应用于患有肾上腺肿瘤的患者样本，以证明其在样品制备、分析物选择和可量化浓度范围方面的适用性。此外，对患者样本中类固醇丰度的探索性比较支持了之前提出的类固醇结合物在肾上腺皮质癌与肾上腺皮质腺瘤之间作为区分生物标志物的潜力。例如，在血浆中，17-羟基孕烯醇硫酸盐的中位浓度在肾上腺皮质癌患者中为114 ng/ml，而在肾上腺皮质腺瘤患者中仅为3.76 ng/ml（p < 0.001）。

这项新开发的方法能够对人类体液中的多种类固醇结合物进行绝对定量，这为深入研究类固醇结合物作为生物标志物的潜力奠定了基础，同时也为相关研究问题提供了有价值的数据。类固醇结合物的分析不仅有助于理解其在生理和病理过程中的作用，还可能对肾上腺肿瘤的早期检测产生重要影响。

在人类尿液和血浆中，类固醇的分析是诊断、预后评估和监测多种人类状况的重要手段，例如影响肾上腺的内分泌疾病、依赖类固醇的癌症或反兴奋剂状态。类固醇在肾上腺皮质或周围生殖器官中合成。在代谢方面，它们通常被结合到硫酸盐或葡萄糖醛酸盐基团上，并主要通过肾脏排出，但也可能通过肝脏进入胆汁，或在唾液和汗液中存在。在过去，类固醇结合物被认为是代谢的终产物，因为它们在核类固醇受体上的活性相对较低。然而，类固醇硫酸盐可以通过普遍表达的类固醇硫酸酯酶进行水解，从而发挥自由类固醇的作用。

近年来，类固醇代谢在肾上腺肿瘤中的病理生理学作用已成为研究热点。两项最近的研究表明，完整类固醇结合物可能在肾上腺皮质癌的诊断和预后评估中具有重要价值。Bancos等人曾提出，尿液类固醇分析可能在改善肾上腺肿瘤的临床鉴别诊断方面发挥重要作用。然而，由于商业上类固醇结合物的参考标准供应不足，以及酶水解过程可能存在的不完整性和重复性问题，类固醇结合物的定量分析在实际操作中面临诸多挑战。

本研究开发了一种针对尿液和血浆样本的高灵敏度、高选择性和高定量性的LC-MS/MS方法，能够同时分析多种类固醇结合物。该方法的建立不仅依赖于精确的色谱分离条件，还结合了优化的质谱参数，以确保分析的准确性与可重复性。通过这一方法，我们能够获得有关类固醇结合物浓度的详尽数据，从而进一步探讨其在肾上腺肿瘤中的生理和病理意义。

在方法开发过程中，我们采用了多种策略以确保样品制备的高效性与准确性。首先，我们选择了一种改良的反相色谱柱，以实现对多种类固醇结合物的快速分离。其次，我们对样品制备流程进行了优化，采用简单的蛋白沉淀和氮气蒸发浓缩步骤，以减少操作时间和成本。此外，我们对质谱参数进行了详细优化，确保所有分析物在最佳条件下被检测。对于样品的定量分析，我们采用了内标法，并通过一系列验证实验，包括校准曲线、灵敏度、交叉污染、回收率、基质效应和稳定性测试，以确保方法的可靠性。

在方法验证过程中，我们对尿液和血浆样本进行了广泛的测试，以确保其符合国际标准。结果表明，该方法在精度、准确性和灵敏度方面均表现优异，能够满足临床研究的需求。此外，该方法在不同样品稀释倍数下仍保持良好的分析性能，这为临床样本的处理提供了便利。

通过对肾上腺皮质癌和肾上腺皮质腺瘤患者样本的分析，我们发现多个类固醇结合物在肾上腺皮质癌患者的尿液和血浆中表现出显著的浓度差异。例如，在血浆中，17-羟基孕烯醇硫酸盐的浓度在肾上腺皮质癌患者中显著高于肾上腺皮质腺瘤患者，这为类固醇结合物作为生物标志物的潜力提供了进一步的证据。此外，一些类固醇葡萄糖醛酸盐在肾上腺皮质癌患者中的浓度也明显高于肾上腺皮质腺瘤患者。

尽管该方法能够检测多种类固醇结合物，但由于类固醇代谢产物的多样性，仍然无法涵盖所有可能的化合物。此外，由于商业上类固醇结合物的参考标准供应有限，这也成为方法开发和应用的一大挑战。因此，未来的研究需要进一步探索类固醇结合物的多样性及其在不同病理状态下的变化。

本研究的结论表明，该方法在尿液和血浆样本的分析中具有高度的适用性，能够提供可靠的定量数据，为类固醇结合物的生物标志物研究奠定基础。通过分析肾上腺肿瘤患者的尿液和血浆样本，我们不仅能够获得关于类固醇结合物浓度的详尽信息，还能够进一步探讨其在疾病形成和进展中的作用。这些数据对于提高肾上腺皮质癌的早期诊断率、改善患者预后以及减少不必要的医疗负担具有重要意义。

此外，该方法的开发和应用为研究类固醇代谢提供了新的视角，特别是在内分泌疾病和肿瘤诊断方面。通过直接分析完整类固醇结合物，而不是先进行水解处理，我们能够避免因酶水解过程可能产生的误差和不完整性，从而更准确地反映类固醇在体内的真实代谢状态。这种分析方法不仅适用于肾上腺肿瘤的研究，还可能扩展到其他依赖类固醇的疾病领域，如激素依赖性癌症或运动员的反兴奋剂检测。

总的来说，本研究提出了一种高效的LC-MS/MS方法，能够在尿液和血浆样本中实现对多种类固醇结合物的绝对定量分析。该方法的建立不仅有助于理解类固醇代谢的复杂性，还为类固醇结合物作为生物标志物的潜力提供了新的证据。随着更多研究的开展，类固醇结合物可能成为肾上腺肿瘤诊断和治疗监测的重要工具，从而为临床实践带来实质性的改进。