使用HPLC-MS/MS和HPLC-Q-Orbitrap-HRMS技术对Crepidatin在人肝微粒体和肝细胞中的体外代谢谱进行表征

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Characterization of In Vitro Metabolic Profiles of Crepidatin in Human Liver Microsomes and Hepatocytes Using HPLC-MS/MS and HPLC-Q-Orbitrap-HRMS

Crepidatin代谢途径研究：建立高效液相色谱-质谱联用方法，在肝微粒体和肝细胞中检测到15种代谢产物，主要经羟基化（M5、M7）和葡萄糖醛酸化（M14）途径，CYP3A4、2C8、2C19及UGT1A1、1A8、1A9为关键酶，证实其通过正交醌和醌甲基化物生物活化。

　　近年来，随着天然药物研究的深入，越来越多的植物来源化合物被发现具有潜在的药理活性。Dendrobium（石斛）作为一种传统中药，不仅在中国有着悠久的使用历史，也被认为是一种具有多种健康益处的功能性食品。石斛被广泛用于调节血糖、改善视力和消化系统健康、缓解神经疾病以及作为退热和抗炎药物。随着现代科学的进步，石斛中分离出的化合物种类日益增多，包括二苯乙烯类、多糖、氨基酸、倍半萜、黄酮类、酚酸、生物碱和类固醇等。其中，二苯乙烯类化合物是石斛中最重要的活性成分之一，已从52种石斛植物中鉴定出267种结构明确的二苯乙烯衍生物。

在这些化合物中，crepidatin（创皮因）因其对肺癌的抑制作用而受到广泛关注。研究表明，crepidatin能够诱导细胞脱落（anoikis），并显著抑制肺癌细胞的生长。此外，crepidatin还显示出对脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤具有显著的保护作用，特别是在10、40和80 mg/kg的剂量下。这些特性使得crepidatin成为一种具有潜在治疗价值的化合物，尤其是在肺癌治疗领域。然而，尽管crepidatin在抗癌方面表现出色，其在人体内的代谢过程仍然是一个尚未完全阐明的领域。

药物代谢在药物发现和开发过程中起着至关重要的作用，因为它直接影响药物的药代动力学参数，如血浆暴露量、峰浓度和生物半衰期。这些参数不仅决定了药物的疗效，还与药物的毒副作用密切相关。因此，理解药物的代谢过程对于评估其临床应用至关重要。特别是在药物代谢过程中，可能会形成具有化学活性的代谢产物，这些代谢产物能够与细胞大分子发生共价结合，从而引发药物诱导的肝毒性。这种机制已被广泛研究，并被认为是药物安全性和有效性评估的重要依据。

为了预测人体内的药物代谢情况，通常会采用体外模型，如人类肝微粒体和肝细胞。肝微粒体因其操作简便和商业供应充足而被广泛使用，但它们缺乏完整的细胞膜，无法完全模拟肝脏的生理环境。相比之下，肝细胞则更接近真实的生理条件，能够提供更全面和详细的代谢信息。因此，在研究药物代谢时，肝细胞被认为是更合适的模型。然而，现有的分析方法在灵敏度和分析效率方面仍有不足，尤其是在处理生物样本时，需要一种更高效、更敏感的分析技术。

目前，用于crepidatin定量分析的方法主要依赖于液相色谱-紫外检测（LC-UV）。虽然这种方法在一定程度上能够满足分析需求，但其分析时间较长（约11分钟），且灵敏度较低（1.0 μg/mL），这限制了其在生物样本分析中的应用。为了进一步推动crepidatin的临床前研究，亟需一种更简单、更快速、更敏感的生物分析方法。超高效液相色谱（HPLC）与三重四极杆质谱（MS/MS）或轨道阱高分辨率质谱（Orbitrap-HRMS）的结合，为药物和代谢产物的分析提供了更强大的平台。这种技术不仅能够提高分析的灵敏度和选择性，还能通过数据后处理技术，如背景扣除、同位素过滤、提取离子色谱图（EIC）和多重质量缺陷过滤（MMDF），增强色谱峰的识别能力，从而减少干扰峰的影响。

此外，通过结构导向的精确质量测量和碎片离子分析，可以更准确地定位代谢产物的结构。因此，建立一种基于质谱的简单且灵敏的分析方法对于crepidatin的代谢研究至关重要。在本研究中，我们旨在开发并验证一种适用于人类肝微粒体和肝细胞孵育中crepidatin定量分析的高效液相色谱-质谱/质谱（HPLC-MS/MS）方法。该方法的优化目标包括提高离子丰度和灵敏度，同时简化样品处理流程并提高分析效率。通过系统优化色谱和质谱条件，我们确保了方法的准确性和可靠性。

为了进一步了解crepidatin的代谢特性，我们还应用了HPLC-Q-Orbitrap-HRMS技术对代谢产物进行了结构鉴定。通过精确质量测量和碎片离子分析，我们成功鉴定了15种代谢产物，并将其归类到五个不同的代谢途径中。其中，羟基化和葡萄糖苷化是主要的代谢途径。此外，我们还研究了crepidatin在补充谷胱甘肽（GSH）的人类肝微粒体中的代谢情况，发现形成了三种GSH结合产物，这为crepidatin的生物活化提供了直接证据。这些生物活化产物包括邻苯醌和醌甲基化物，这些化合物可能在药物代谢过程中发挥重要作用。

为了进一步支持crepidatin的代谢研究，我们还鉴定出了参与其代谢的关键人类细胞色素P450（CYP）和UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UGT）酶。这些酶在药物代谢过程中起着至关重要的作用，包括CYP3A4、2C8、2C19、UGT1A1、UGT1A8和UGT1A9。通过这些研究，我们不仅获得了crepidatin的代谢特征，还为预测其在体内的药代动力学提供了重要的理论依据。

本研究还探讨了crepidatin在体外模型中的代谢稳定性。通过使用HPLC-MS/MS方法，我们评估了crepidatin在人类肝微粒体和肝细胞中的代谢速率。结果显示，crepidatin在肝微粒体中的半衰期为17.2分钟，在肝细胞中的半衰期为10.8分钟。这表明crepidatin在体外模型中具有较快的代谢速率，这可能与其在体内的代谢情况相似。此外，通过HPLC-Q-Orbitrap-HRMS技术，我们成功鉴定了15种代谢产物，并对其结构进行了详细的分析。这些代谢产物的结构特征为理解crepidatin的代谢途径提供了重要的信息。

为了确保方法的准确性，我们还进行了系统的验证。该方法在浓度范围1.0-1000 nM内表现出良好的线性关系（r > 0.999），并且具有较高的灵敏度（LLOQ 1.0 nM）。此外，该方法的分析时间较短（仅需2.0分钟），这使得其在高通量分析中具有显著优势。通过这种方法，我们不仅能够高效地分析crepidatin在体外模型中的代谢情况，还能够为预测其在体内的药代动力学提供可靠的数据支持。

在本研究中，我们还关注了crepidatin的代谢途径及其生物活化机制。通过HPLC-Q-Orbitrap-HRMS技术，我们发现crepidatin主要通过羟基化和葡萄糖苷化途径进行代谢。这些代谢途径可能在药物代谢过程中发挥重要作用，并且可能影响药物的生物利用度和安全性。此外，我们还发现crepidatin在补充谷胱甘肽（GSH）的肝微粒体中形成了三种GSH结合产物，这为crepidatin的生物活化提供了直接证据。这些生物活化产物可能在药物代谢过程中具有重要的生物学意义。

为了进一步支持crepidatin的代谢研究，我们还鉴定出了参与其代谢的关键人类酶。这些酶包括CYP3A4、2C8、2C19、UGT1A1、UGT1A8和UGT1A9。这些酶在药物代谢过程中起着至关重要的作用，并且可能影响药物的代谢速率和代谢产物的形成。通过这些研究，我们不仅获得了crepidatin的代谢特征，还为预测其在体内的药代动力学提供了重要的理论依据。

综上所述，本研究开发并验证了一种适用于crepidatin在体外模型中代谢分析的高效液相色谱-质谱/质谱（HPLC-MS/MS）方法。该方法具有快速、灵敏和简便的特点，能够为高通量分析提供支持。通过该方法，我们不仅评估了crepidatin的代谢稳定性，还成功鉴定了其代谢产物的结构，并揭示了其代谢途径和生物活化机制。这些研究结果不仅有助于深入理解crepidatin的代谢特性，还为预测其在体内的药代动力学提供了重要的参考。此外，通过鉴定关键的代谢酶，我们为进一步研究crepidatin的代谢机制奠定了基础。这些发现对于推动crepidatin的临床前研究和潜在的临床应用具有重要意义。