《Journal of Pharmaceutical Sciences》：Navigating PUPSIT implementation challenges for high-viscosity oligonucleotide drug products
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欧盟EMA Annex 1修订后强制实施PUPSIT测试，本研究针对高粘度反义寡核苷酸（ASO）制剂，通过优化PUPSIT系统设计（包括湿法策略、冲洗能力、冗余配置）解决了传统过滤灭菌对膜性能的影响问题，验证了γ辐照显著改变滤膜机械强度和孔径特性，为复杂生物制剂的无菌工艺控制提供新策略。
余（佐伊）·张 | 约瑟夫·佩尔基亚卡 | 安雅·巴塔利娜 | 梅里·维特 | 乔治·德·拉·罗萨 | 建·卢 | 安德森·麦克劳德 | 阿尔卡·普拉舍尔 | 詹姆斯·科兰登 | 迈克尔·芒瑟
药品开发 - 无菌产品、药物开发与供应，GSK，美国宾夕法尼亚州科尔维尔市南学院大道1250号，邮编19426
摘要
修订后的欧盟（EU）EMA附录1（2023年8月生效）对无菌注射剂生产工艺的设计和操作提出了更严格的要求。其中，使用前和灭菌后的完整性测试（PUPSIT）给制药行业带来了重大挑战，需要采取战略性的调整以确保合规性。基于寡核苷酸的疗法作为针对未满足医疗需求的靶向治疗手段，已经获得了发展势头。然而，由于这些产品对热敏感，通常需要无菌处理，因此必须实施PUPSIT。本案例研究重点介绍了高浓度、高粘度反义寡核苷酸（ASO）药品在PUPSIT方面面临的关键挑战，并探讨了配方影响、工艺设计和风险评估等关键因素。研究结果提供了关于实际挑战、行业最佳实践以及如何在保持监管合规性的同时成功实施PUPSIT的策略。
引言
无菌过滤是确保热敏性注射剂产品无菌性和安全性的关键步骤。长期以来，监管机构一直要求在过滤后对过滤器进行完整性测试。随着2022年发布的欧盟附录1的修订，并于2023年8月生效，使用前和灭菌后的完整性测试（PUPSIT）在欧洲成为强制性要求。PUPSIT的目的是降低两个主要风险：首先，通过防止“缺陷掩盖”来提高无菌保证——即堵塞的孔隙可能在使用后测试中掩盖过滤器的不完整性；其次，减少因灭菌或运输过程中过滤器损坏导致的批次损失带来的业务风险。1, 2
目前，全球范围内尚未就PUPSIT的要求达成共识。在欧盟内部，除非提供科学合理且有充分依据的豁免理由，否则在欧盟市场上销售的商品产品和在欧盟境内制造的临床阶段产品都必须实施PUPSIT。例外情况通常基于风险评估，例如缺陷掩盖或过滤器污染的风险较低、测试过程中的压力条件可能导致泄漏风险较高，或者小批量产品的损失较大。
众所周知，实施PUPSIT是一项复杂的任务。它需要复杂的系统设计，如果实施不当可能会导致污染，并增加整体工艺的复杂性。成功实施PUPSIT在很大程度上依赖于周密且针对具体产品的系统设计。PUPSIT系统的配置不仅决定了操作的便利性，还决定了同一灌装线上可以使用的产品数量。如图1所示，PUPSIT的设计要素（包括润湿策略、冲洗能力和冗余性）会显著影响在线完整性测试的成功。
例如，过滤器可以用药品本身或水/缓冲液进行润湿（图1B和1D）。使用水或缓冲液润湿通常能更有效地实现膜完全饱和，避免高价值药品的损失，并从操作角度减少不同产品的润湿差异。然而，当使用水/缓冲液润湿时，通常需要用药品进行适当的冲洗步骤以避免产品稀释。这种配置需要配备一个收集废液的冲洗袋，这会增加空间需求和操作复杂性——尤其是在基于隔离器的灌装线上。同样，增加冗余过滤器（图1C和1D）可以在主要过滤器确认完整性的情况下，为批次无菌性提供额外的风险缓解。
在过去十年中，包括小干扰RNA（siRNA）、反义寡核苷酸（ASO）、适配体和合成mRNA在内的寡核苷酸疗法在针对以前无法治疗的途径方面显示出巨大潜力，从而建立了全新的治疗模式来满足未满足的医疗需求。截至撰写本文时，约有20种基于寡核苷酸的药品在美国和欧盟获得了商业批准。3
在本案例研究中，PUPSIT系统采用了传统设计（图1A），该设计符合欧盟GMP附录1（2008年版）的规定，即“最终灭菌过滤应尽可能靠近灌装点”。3因此，一个灭菌级过滤器被放置在A级隔离器内，并通过1.8米长的硅胶管连接到外部完整性测试仪。这种配置，加上无表面活性剂的高粘度寡核苷酸配方的复杂性，在后期开发过程中给PUPSIT的实施带来了重大障碍。值得注意的是，我们的研究结果挑战了“过滤器灭菌方法不会影响过滤器性能规格”的传统观点，证明了伽马辐照会显著改变特定药品的完整性测试限值。通过系统研究，我们成功为后期项目制定了PUPSIT的验收标准，为无菌药品的PUPSIT实施提供了实际指导。
部分内容摘录
材料
本研究使用的过滤器包括：Durapore? 0.22 μm PVDF亲水膜过滤器（未经伽马辐照）、Durapore? 0.22 μm PVDF亲水膜过滤器（经过25 kGy剂量的伽马辐照）；Durapore? 0.22 μm PVDF亲水膜过滤盘（未经处理和经过25 kGy剂量的伽马辐照），以及Millipore Express? 0.22 μm PES亲水膜过滤盘（未经处理和经过25 kGy剂量的伽马辐照）。
ASO配方是通过将冻干药物溶解在注射用水（WFI）中制备的
ASO药品在PUPSIT实施过程中遇到的挑战
ASO药品是通过将冻干药物溶解在注射用水（WFI）中制备的，随后调整至目标pH值和浓度，进行生物负荷减少过滤，然后在隔离器内进行在线无菌过滤。生物负荷减少过滤和最终无菌过滤均使用了同一灭菌级PVDF过滤器。生物负荷减少过滤器的完整性测试是在过滤后离线进行的，以确认其完整性
讨论
对于高粘度寡核苷酸药品来说，实施PUPSIT带来了重大的科学和操作挑战，尤其是在后期开发阶段，此时配方限制和固定的系统配置限制了灵活性。
ASO与伽马辐照过滤膜之间的相互作用特性揭示了基于BP的PUPSIT方法所面临的挑战（图3）。升高的表面张力，加上
结论
本案例研究表明，对于复杂、无表面活性剂的高粘度ASO配方，传统的假设（如过滤器灭菌方法的影响微乎其微）可能并不成立。药品的理化性质以及PUPSIT装置的设计（包括管路长度、冲洗能力和相对于灌装点的位置）对可行性和测试结果有着深远影响。
总体而言，这些发现强调了
免责声明
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关于PES膜的表征（包括扫描电子显微镜观察、静态接触角和动态接触角）详见补充材料。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢Stephanie Lam分享了一些概念的观点。特别感谢Ray Sanchez在成功概率统计分析方面提供的支持。
