《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Integrated analysis strategies reveal the pharmacodynamic substances and action mechanisms of Huangqi San in the treatment of Alzheimer’s disease
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黄芪散（HQS）通过调节PI3K/AKT/MAPK通路抑制Aβ25-35诱导的神经毒性，保护PC12细胞活力，降低炎症和氧化应激标志物。研究采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS鉴定血清中40个成分，网络药理学和分子对接揭示10个核心成分与BCL2、MAPK3等靶点的结合，证实HQS通过多靶点协同作用发挥抗阿尔茨海默病疗效。
邢宇|南莉|徐莉|宣崔|芮菊|李明明|赵家秀|韩飞
沈阳药科大学药学院，中国辽宁省沈阳市沈河区文华路103号，邮编110016
摘要
阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，早期主要表现为记忆障碍，给社会和医疗资源带来了沉重负担。本研究旨在探讨黄芪散（HQS）对AD的治疗效果，并阐明其潜在的作用机制。通过UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术分析了经HQS处理后的大鼠血清，鉴定出其潜在的有效成分。随后利用网络药理学和分子对接技术确定了关键靶点和信号通路，并在受Aβ25-35损伤的PC12细胞中进行了验证。验证方法包括细胞活力测定、炎症/氧化应激标志物分析以及PI3K/AKT/MAPK通路的调节。结果显示，共鉴定出40种血清吸附成分和70个共同靶点。网络分析表明，PI3K-AKT、MAPK和Rap1信号通路是该网络的核心。分子对接显示10种核心成分（如异黄酮苷、莫拉辛M）与关键靶点（BCL2、MAPK3、PTGS2）之间存在强烈的结合亲和力。体外实验表明，HQS通过提高细胞活力、抑制细胞凋亡、减少促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和氧化标志物（MDA、ROS、CYP2E1）以及增强GSH-Px活性，显著减轻了Aβ25-35诱导的神经毒性。此外，HQS可通过上调PI3K/AKT/ERK1/2和抑制JNK/p38磷酸化来双向调节PI3K/AKT/MAPK通路。总之，本研究创新性地将HQS确立为一种多组分/多靶点的AD治疗候选药物，其作用机制与其对PI3K/AKT/MAPK介导的神经保护的协同调节有关。这种综合方法为解读复杂的中药制剂提供了范例。
引言
阿尔茨海默病（AD）是全球最常见的神经退行性疾病，其特征是进行性认知障碍、神经炎症和突触功能障碍，病理学标志包括β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块和由过度磷酸化的Tau蛋白组成的神经纤维缠结[1]、[2]。尽管通过多种假说（如Aβ级联反应、Tau病理学和胆碱能功能障碍）[3]、[4]加深了对AD发病机制的理解，但目前FDA批准的药物（胆碱酯酶抑制剂和NMDA拮抗剂）仅能缓解症状，无法阻止疾病进展[5]、[6]。值得注意的是，AD的复杂性要求采用多靶点治疗策略，这与中医整体论治疗多因素疾病的方法是一致的[7]、[8]。
黄芪散（HQS）是一种记载于《圣济总录》（北宋时期）的经典中药方剂，由黄芪根（AR）、葛根（PR）和 Mori Cortex（MC）按1:2:1的比例组成，已被证明对代谢性疾病有效[9]、[10]。有趣的是，新证据表明HQS在AD模型中具有神经保护作用。例如，研究表明AR对AD具有治疗效果，可减少神经元丢失和细胞凋亡，并增强AD诱导的大鼠模型的学习和记忆能力[11]；PR也能显著改善小鼠的认知功能障碍[12]。然而，HQS的确切有效成分及其作用机制尚未阐明，一些关键问题仍未得到解答：哪些血清吸附成分介导了其中枢神经系统（CNS）效应？这些成分如何共同调节AD相关通路？其预测的多靶点机制能否通过实验验证？解决这些问题是将HQS从经验性应用转化为基于证据的AD治疗的关键。
为填补这些知识空白，我们采用了综合方法。首先，使用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术鉴定了AD模型大鼠血清中的HQS衍生物成分，确立了药效学基础。接着，通过网络药理学确定了这些成分可能协同作用的关键靶点（如BCL2、MAPK3）和通路（PI3K/AKT/MAPK），并通过分子对接进一步验证了成分-靶点相互作用。最后，利用Aβ25-35损伤的PC12细胞确认了HQS恢复神经元活力、抑制炎症/氧化应激以及双向调节PI3K/AKT/MAPK信号通路的能力，从而提供了将HQS化学组成与其抗AD效果联系起来的首个机制证据。
实验方法片段
HQS样品制备
所有草药均购自中国沈阳的沈阳国大药房。HQS粉末的制备方法为：按重量比1:2:1用水提取黄芪根（AR）、葛根（PR）和Mori Cortex（MC）。具体步骤为：称取7.5克AR、15克PR和7.5克MC，加入10倍体积的水浸泡1小时，然后进行1.5小时的回流提取。用8层纱布过滤残渣，再加入8倍体积的水，用相同方法进行1小时的回流提取。将两次提取的滤液合并。
鉴定大鼠血清中的HQS多种成分
图1展示了使用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）对给药血清样本和空白血清对照进行的总离子色谱图（TIC），展示了正负离子检测模式下的数据。综合分析显示，大鼠血液中检测到了40种化学成分，包括10种黄酮类化合物（如3′-羟基葛根素）和9种氨基酸化合物（如色氨酸）以及6种有机酸化合物。
结论
本研究分析了大鼠体内吸收的HQS化学成分，利用网络药理学和分子对接技术系统预测了其有效成分、靶点及可能在AD治疗中发挥作用的PI3K/AKT/MAPK信号通路。此外，通过细胞药效学评估证实HQS具有保护作用。HQS的作用机制表明，它可能有效缓解Aβ25-35引起的神经毒性。
作者贡献声明
李明明：数据整理。芮菊：方法学研究。宣崔：方法学研究。徐莉：初稿撰写及实验研究。南莉：初稿撰写。邢宇：审稿与编辑、数据可视化。韩飞：项目监督。赵家秀：数据整理。
作者贡献声明
邢宇负责手稿的撰写、审稿和编辑工作。南莉和徐莉负责实验的实施和初稿撰写。宣崔和芮菊参与了动物实验的进行。李明明和赵家秀参与了数据分析。韩飞（hanfei_spu@163.com）设计了实验方案，监督了所有实验的执行，并确认了手稿中的最终数据。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了辽宁省科技计划联合项目（自然科学基金一般项目）（2024011772-JH4/4800）、辽宁省教育厅项目（JYTMS20231378）、天津市自然科学基金（项目编号21JCYBJC01630）、天津市自然科学基金（项目编号23JCYBJC00410）以及沈阳药科大学青年教师职业发展支持计划（项目编号ZQN2018007等）的支持。
