中国首次分离出多重抗真菌药物耐药的红色毛癣菌及其新型耐药机制

《MYCOSES》：The First Isolation of Multiple Antifungal-Drug-Resistant Trichophyton Rubrum in China and the Novel Resistance Mechanism

中国首次分离出对特比萘芬和伊曲康唑耐药的红色毛癣菌L-6424菌株，通过基因组测序发现其携带SQLE基因的新突变V105M和已知耐药突变F397L、H440Y，以及CYP51A的R239C突变。转录组分析显示耐药相关基因CYP51A、TruMDR5和TERG_08139表达上调，提示多药耐药机制。该菌株与参考菌株遗传相似度高达99.94%，表明耐药性源于复杂机制而非新基因型。

　　近年来，随着全球范围内真菌感染的增加，抗真菌药物耐药性的出现引起了医学界的广泛关注。尤其是皮肤癣菌（dermatophytes）这类真菌，因其对多种抗真菌药物的耐药性而成为临床治疗的一大挑战。其中，**红色毛癣菌**（*Trichophyton rubrum*）作为最常见的皮肤癣菌之一，长期以来占据着全球真菌感染的主导地位，尤其在引起甲癣（onychomycosis）和体癣（tinea corporis）方面尤为突出。然而，近年来，一些耐药性突变的报道逐渐增多，表明这种真菌在某些地区已展现出对一线抗真菌药物的耐药能力。在中国，尽管红色毛癣菌的感染率居高不下，但关于其耐药性的研究仍相对较少，缺乏系统的临床和分子机制分析。本文首次报道了在中国患者中分离出一种对多种抗真菌药物具有耐药性的红色毛癣菌株L-6424，这一发现不仅揭示了该菌株的耐药特性，还进一步探讨了其潜在的耐药机制。

### 临床背景与研究意义

红色毛癣菌是一种亲人性真菌，能够通过人与人之间的传播，感染不同年龄层的人群，并且能够侵袭皮肤、指甲和头发中的角蛋白。在免疫功能低下的患者中，这种真菌甚至可能引发更深层次的皮肤感染。由于其广泛的传播性和高致病性，红色毛癣菌一直是临床抗真菌治疗的重点对象。然而，随着抗真菌药物的广泛应用，耐药性菌株的出现正在成为公共卫生领域的一个新问题。特别是在一些国家和地区，如美国、日本、希腊和中国，已有报道指出红色毛癣菌对传统药物如特比萘芬（terbinafine）和伊曲康唑（itraconazole）的耐药性正在上升。这些耐药性菌株不仅使患者的治疗变得更加困难，还可能导致感染反复发作、病情加重，从而对患者的生活质量和社会经济造成沉重负担。

本文研究的L-6424菌株，来自一位患有广泛性体癣、股癣、甲癣和手癣的中国患者，其对多种抗真菌药物表现出耐药性，包括特比萘芬、伊曲康唑、氟康唑和阿莫罗芬。这一发现不仅具有重要的临床意义，也提示我们应加强对真菌耐药性的关注，并在治疗方案中更加谨慎，以避免耐药性进一步扩散。

### 实验方法与技术手段

为了准确鉴定该菌株并分析其耐药性，研究人员采用了多种现代生物技术手段。首先，通过**ITS（内部转录间隔区）测序**和**系统发育分析**确认了该菌株的物种身份。ITS测序是目前鉴定真菌种类的一种常用方法，因其具有高度的物种特异性，能够有效区分不同真菌种类。随后，通过**体外抗真菌药敏试验**（AFST）评估了该菌株对八种常见抗真菌药物的敏感性，包括特比萘芬、伊曲康唑、氟康唑、阿莫罗芬、灰黄霉素、伏立康唑、 luliconazole 和两性霉素B。这一试验基于CLSI（临床与实验室标准研究所）M38-A3指南进行，以确定不同药物的最小抑制浓度（MICs），从而判断其是否具有耐药性。

为了深入探讨耐药性的分子机制，研究团队进一步进行了**全基因组测序（WGS）**和**转录组测序**，并结合**定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）**对关键候选基因的表达水平进行了验证。通过这些方法，研究人员不仅获得了菌株的基因组信息，还能够分析其在药物压力下的基因表达变化，从而揭示耐药性的潜在分子机制。

此外，研究团队还对75个红色毛癣菌菌株进行了**基于单核苷酸多态性（SNP）的系统发育分析**，构建了最大似然树（maximum likelihood tree），以评估L-6424菌株在遗传上的相似性及其在种群中的分布情况。结果显示，L-6424菌株与参考菌株CBS 139224在基因组水平上具有极高的相似性（99.94%），表明其并非新的基因型，而是可能通过某些突变或表达调控机制表现出耐药性。

### 耐药性表型与基因突变分析

通过对L-6424菌株的药敏测试，研究人员发现其对特比萘芬的MIC值为2 mg/L，这远高于普通菌株的MIC值（通常≤0.002 mg/L），表明其对特比萘芬具有显著的耐药性。同样，对伊曲康唑和阿莫罗芬的MIC值分别为0.5 mg/L和0.5 mg/L，也远高于标准敏感菌株的MIC值。这些结果表明，L-6424菌株对这些药物表现出多重耐药性，这一特性在临床中尤为值得关注。

在基因层面，研究人员对L-6424菌株的**SQLE基因**（编码角甾醇合成关键酶）进行了深入分析，发现了三个氨基酸替换：F397L、H440Y和新发现的V105M。其中，F397L和H440Y这两种突变此前已被报道与特比萘芬耐药性相关，而V105M则是一个新的耐药性相关突变。此外，在**CYP51A基因**中也检测到了一个氨基酸替换（R239C），这可能与azole类药物的耐药性有关。CYP51A基因编码的是一种重要的细胞色素P450酶，该酶在抗真菌药物（如伊曲康唑）的作用机制中起着关键作用，其突变可能导致药物的靶点发生改变，从而降低药物的疗效。

除了基因突变外，研究团队还通过**转录组分析**发现，L-6424菌株在多个基因表达水平上与敏感菌株存在显著差异。在GO（基因本体）和KEGG（京都基因与基因组百科全书）功能富集分析中，L-6424菌株的上调基因主要集中在氧化还原过程、小分子代谢、氧化还原酶活性、异构酶活性和小分子生物合成等通路，而下调基因则主要涉及核仁、非编码RNA处理、核糖体生物合成和脂肪酸代谢等过程。这些基因表达的改变可能反映了菌株在面对药物压力时，通过调整代谢途径和应激反应机制，提高自身的生存能力，从而表现出耐药性。

此外，研究人员还对**候选基因**（如CYP51A、TruMDR5和TERG_08139）进行了qRT-PCR验证，发现这些基因在L-6424菌株中显著上调，表明它们可能在耐药性形成过程中发挥了重要作用。其中，TruMDR5基因属于ABC转运蛋白家族，其功能是通过主动运输将药物排出细胞外，从而降低药物对细胞的毒性。这种机制在其他真菌中已被广泛研究，但在红色毛癣菌中仍较为少见。

### 耐药性机制的复杂性与挑战

研究结果表明，红色毛癣菌的耐药性机制是多方面的，不仅涉及基因突变，还包括基因表达调控和转运蛋白的激活。在本研究中，L-6424菌株的耐药性可能是由多种因素共同作用的结果，例如SQLE基因的突变、CYP51A基因的改变，以及TruMDR5和TERG_08139等基因的上调表达。这些机制的相互作用使得耐药性的形成更加复杂，也增加了临床治疗的难度。

值得注意的是，尽管CYP51A和CYP51B基因的突变已被广泛认为是azole类药物耐药性的主要原因，但在L-6424菌株中并未发现CYP51B基因的拷贝数变异（CNV），这可能意味着该菌株的耐药性并非完全依赖于这些基因的改变。此外，研究人员还对**结构变异**（如SNPs、InDels和基因组重排）进行了分析，发现这些变异可能对菌株的耐药性产生重要影响。

从系统发育分析来看，L-6424菌株与其他红色毛癣菌株在基因组层面具有高度相似性，但其耐药性可能源于某些特定的基因突变或表达调控。这种耐药性的出现提示我们，即使是高度相似的菌株，也可能在某些关键基因上存在细微差异，这些差异可能成为耐药性的关键驱动因素。

### 临床启示与公共卫生影响

本文的研究结果对临床实践具有重要的指导意义。首先，L-6424菌株的耐药性表明，抗真菌药物的使用需要更加谨慎，特别是在长期治疗过程中，应避免药物滥用，以减少耐药性菌株的出现。其次，对于反复发作或治疗无效的真菌感染，临床医生应考虑是否存在耐药性，并根据药敏测试结果选择合适的药物。此外，耐药性菌株的出现也提示我们需要加强对真菌耐药性的监测，尤其是在高发地区，如中国。

另一方面，从公共卫生角度来看，红色毛癣菌的耐药性问题正在成为一个日益严峻的挑战。随着耐药性菌株的增加，传统的抗真菌治疗方案可能不再有效，这不仅影响患者的治疗效果，还可能对公共卫生政策提出新的要求。例如，加强抗真菌药物的合理使用，推广新的抗真菌药物，以及开展更深入的耐药性机制研究，都是应对这一问题的关键措施。

### 结论与展望

综上所述，本文首次在中国患者中分离出一种对多种抗真菌药物具有耐药性的红色毛癣菌株，并对其耐药机制进行了深入分析。研究发现，该菌株的耐药性可能与SQLE和CYP51A基因的突变，以及TruMDR5和TERG_08139等基因的上调表达有关。这一发现不仅揭示了红色毛癣菌耐药性的潜在机制，也提醒我们，在面对真菌感染时，必须采取更加全面和科学的治疗策略。

未来的研究可以进一步探讨这些基因突变与耐药性之间的具体关系，例如V105M突变是否确实与特比萘芬耐药性有关，以及TERG_08139基因在代谢途径或毒力因子中的具体作用。此外，还需要关注耐药性菌株的传播路径和地理分布，以制定更加有效的防控措施。在全球范围内，真菌耐药性的增加已经成为一个不容忽视的问题，因此，加强国际合作，推动抗真菌药物的开发和合理使用，是应对这一挑战的关键。

总之，红色毛癣菌的耐药性问题不仅影响个体的健康，也对公共卫生构成威胁。本文的研究为理解这一现象提供了重要的线索，并强调了加强耐药性监测和深入研究的重要性。未来，随着分子生物学技术的不断发展，我们有望揭示更多关于真菌耐药性的机制，并为临床治疗提供更加精准的策略。