综述：两性离子聚合物在储能应用中的研究

《Materials Today Energy》：Zwitterionic polymers in energy storage applications

骨关节炎和运动损伤导致骨软骨组织退化，本研究通过多材料低温3D打印构建双相骨软骨支架，结合生长因子调控间充质干细胞分化，在软骨区使用动态交联水凝胶促进细胞聚集，在骨区负载成骨肽，动物实验显示3个月后支架成功再生出结构整合的骨软骨组织。

　　随着全球人口老龄化趋势的加剧以及运动伤害和创伤性损伤的频繁发生，越来越多的人受到退行性骨关节炎和创伤性软骨下骨损伤的影响，这不仅严重限制了他们的运动功能，也降低了生活质量。传统的治疗方法，如关节镜清创术、微骨折骨髓刺激、自体软骨移植和异体软骨移植，虽然在一定程度上能够缓解炎症、引导内源性间充质干细胞（MSCs）迁移到损伤部位或促进软骨下骨组织的再生，但其广泛应用受限于诸如容易丢失内源性MSCs、软骨下骨组织供体来源有限、免疫排斥反应和感染性疾病等缺点。因此，开发更为先进的治疗策略对于解决软骨下骨缺损问题具有重要意义。

近年来，组织工程支架被视为一种有前景的生物材料，能够模拟细胞在原生组织中的细胞外基质（ECM），从而激活并调控内源性再生过程，为组织修复提供有效的手段。三维（3D）打印技术因其能够生产具有定制形状、微结构和可控物理、化学和生物特性的组织工程支架，被认为是制造此类支架最有力的制造技术之一。相比于单一材料3D打印的支架，多材料3D打印或梯度3D打印技术已被用于制造多相支架，以更好地模拟天然软骨下骨组织的异质特性，并在特定区域促进MSCs沿着成骨或成软骨方向分化。此外，将促成骨或促成软骨的生物分子/药物加载在对应区域，进一步提高了MSCs的成骨/成软骨分化效率。然而，MSCs分化成的软骨样细胞更倾向于表现出纤维软骨表型，尽管与成软骨相关的生物标志物如SOX9、胶原蛋白II（COL II）和聚集蛋白（ACAN）表达水平有所上升。

从细胞发育的角度来看，MSCs成功分化为透明软骨细胞需要经历多个阶段，包括初始细胞聚集、细胞形态调整、成软骨分化启动、细胞成熟和表型维持。其中，初始细胞聚集尤为重要，因为初始细胞形态（球形细胞聚集与分散扩展的细胞）决定了MSCs能否分化为透明软骨细胞还是纤维软骨细胞。因此，支架的软骨区域应具备良好的能力来调节细胞形态，使MSCs形成聚集，从而提高成软骨分化效率。具有动态键的超分子水凝胶允许细胞在水凝胶基质中自由迁移，通过自发聚集形成理想的细胞组织结构。然而，由于这类水凝胶由蛋白质或多糖组成，具有不同的亲水性和降解性，无法保证MSCs在水凝胶中的长期聚集状态。因此，仍需使用如TGF-β1/3等具有诱导MSCs成软骨分化的功能生物分子或药物，以实现成功分化为透明软骨细胞。

在本研究中，我们通过双材料顺序冷冻3D打印技术，定制了一种具有异质特性的双相软骨下骨支架，随后在软骨框架中填充了基于明胶的超分子水凝胶。这种支架能够在不同区域调整MSCs的初始形态，促进其区域性的成软骨/成骨分化，最终实现软骨下骨组织的体内再生。本研究提供了一种简便而多用途的策略，通过调节和维持种子细胞在组织再生过程中的形态，再生异质组织。

实验部分，我们首先准备了用于制造软骨下骨框架的打印墨水。对于软骨下骨框架，将1.5毫升去离子水与10毫升PLGA/二氯甲烷（DCM）溶液（20%，w/v）混合，加入50微升吐温20和4克β-三钙磷酸盐（β-TCP）颗粒，经过5分钟超声处理，形成了含有连续油相（PLGA/DCM）、均匀分布的β-TCP颗粒和离散水相（水滴）的水油复合墨水。随后，将含有10毫克OP和20毫克BSA（稳定剂）的0.5毫升去离子水加入到水/β-TCP/PLGA/DCM乳液中，经过5分钟轻柔的手动混合，形成了用于打印软骨下骨框架的墨水。对于软骨框架，将0.5毫升去离子水与5毫升P(DLLA-TMC)/DCM溶液（30%，w/v）混合，加入10微升吐温20，经过5分钟超声处理，形成了用于打印软骨图案的均匀水油乳液墨水。随后，将含有10微克TGF-β1和2毫克BSA的200微升去离子水加入到水/P(DLLA-TMC)/DCM乳液中，经过5分钟轻柔手动搅拌，形成了用于打印软骨框架的墨水。最后，将含有1.2克明胶、0.8克乙酰化β-环糊精（Ac-β-CD）、0.1克聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和10毫克光引发剂LAP的溶液在45°C下溶解，并在100转/分钟的磁力搅拌下形成超分子水凝胶前体。

在支架的制备过程中，我们使用双喷嘴多材料3D打印技术，在低温环境中（即-20°C）制造了具有盘状结构的软骨下骨支架。首先，打印了10层由OP/β-TCP/PLGA组成的软骨下骨支撑结构，形成了约3毫米高的软骨下骨框架，每层厚度为0.3毫米。每层软骨下骨框架由10根长度在2到10毫米之间、直径为0.4毫米的平行杆组成，杆与杆之间的距离为0.5毫米，相邻层的杆呈90度交叉。在打印完10层软骨下骨框架后，再在打印的最后层杆上精确沉积2层平行的软骨下骨杆，形成了一个“凹凸”结构，总高度为3层。然后，将软骨框架打印在软骨下骨框架顶部，首先打印了3层由TGF-β1/P(DLLA-TMC)组成的软骨杆，以填充软骨下骨框架的“凹凸”结构中的空隙。接着，在打印的平行软骨杆顶部打印了6层网格结构的软骨杆，总高度约为1.2毫米，每层厚度为0.2毫米。随后，将制备好的软骨下骨支架进行10小时的冷冻干燥处理。最后，将超分子水凝胶前体填充到软骨框架的多孔结构中，并在37°C下进行5分钟的紫外光照射以交联超分子水凝胶。

支架的物理特性通过压缩测试、剪切测试和剥离测试进行了评估。压缩测试在37°C的湿条件下进行，每种支架测试了5个样本，每个样本尺寸为10毫米×10毫米×10毫米，应变速率为1毫米/分钟。剪切测试和剥离测试用于研究软骨层与软骨下骨层之间的结合强度。剪切测试按照ASTM D3163标准进行，重叠长度为15毫米，应变速率为1毫米/分钟。剥离测试则按照ASTM D3330方法A（180°剥离）进行。

细胞培养部分，使用了大鼠骨髓来源的MSCs（rBMSCs），在P6代（由iCell Bioscience Inc.提供）进行培养，并在37°C、5% CO?的恒温箱中进行培养。培养液每两天更换一次。当细胞达到80%汇合度时，使用胰蛋白酶-EDTA（Gibco）获得细胞悬液。随后，将0.2毫升浓度为1×10?细胞/毫升的rBMSCs悬液与0.2毫升超分子水凝胶前体混合，并填充到软骨框架中，然后进行5分钟的紫外光交联。之后，将支架倒置，并在软骨下骨区域填充0.2毫升浓度为1×10?细胞/毫升的rBMSCs悬液。

细胞活性检测通过活/死染色和CCK8实验进行。在培养1天和7天后，使用活/死染色试剂盒（Molecular Probes）对rBMSCs进行染色，观察支架中的活细胞和死细胞。细胞染色后，将细胞-支架构建物在含有4微摩尔EthD-1和2微摩尔calcein AM的iCell培养液中孵育30分钟，其中活细胞被染成绿色，死细胞被染成红色。使用荧光显微镜（Nikon Eclipse TE2000-U倒置显微镜）获取荧光图像。细胞增殖情况则通过CCK8实验进行研究。

在体外成软骨/成骨分化方面，我们观察了rBMSCs在不同区域的分化情况。在培养14天后，使用DAPI（细胞核）、GF 488 phalloidin（F-actin）、Genmed Scientifics Inc.的G-actin、SOX9、COL II、ACAN、RUNX2和OCN等生物标志物进行免疫荧光染色，并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察不同区域的细胞核、F-actin、G-actin以及成软骨/成骨标志物的表达情况。

动物实验部分，我们对兔子进行了实验，以评估支架在体内的再生效果。使用耳静脉注射乙基卡巴胆碱（10毫升，0.2克/毫升）进行麻醉。确认麻醉有效后，通过内侧髌骨旁切口进行膝关节切开。然后，将髌骨翻转以暴露股骨关节面。使用钻头制作一个直径4毫米、深度5毫米的圆形软骨下骨缺损。实际位置位于股骨滑车的中心点（纵向滑车沟轴线与股骨内外侧髁中线的交点）。随后，将支架植入每个缺损中。3个月后，所有兔子被二氧化碳处死，取出标本并用4%多聚甲醛（PFA）固定，进行磁共振成像（MRI）和微计算机断层扫描（μ-CT）分析。之后，将标本用EDTA溶液进行3个月的脱钙处理。最后，将标本进行石蜡包埋和组织切片，并使用H&E染色、Masson三色染色、Safranin O-快绿（SO-FG）染色、Alician蓝染色和甲苯胺蓝染色进行组织学分析。

讨论部分指出，尽管已经制备了多种类型的软骨下骨支架以实现整合的软骨下骨再生，但其中具有梯度特性的多材料3D打印支架因其能区域性模拟天然软骨下骨组织的结构和组成特性，受到了越来越多的关注。这些支架在特定区域诱导药物/生物分子加载，从而提高MSCs的成骨/成软骨分化效率。研究人员还尝试使用聚酯和水凝胶构建具有仿生机械强度的软骨下骨支架。然而，由于水凝胶和聚酯（如PCL）的亲水性不同，无法保证足够的界面结合强度。因此，使用具有不同弹性模量的可降解聚酯作为打印墨水，可以制造出具有高结合强度的软骨框架和软骨下骨框架，其中水凝胶填充在多孔软骨框架中，为成软骨细胞/MSCs提供类似ECM的环境，而含有生物陶瓷颗粒的软骨下骨框架则可以直接作为类似骨小梁的骨环境，诱导MSCs的成骨分化。

在本研究中，我们通过双材料顺序冷冻3D打印技术，制造了具有异质结构的双相软骨下骨支架，随后在软骨框架中填充了基于明胶的超分子水凝胶。这种支架具有类似于天然软骨下骨组织的机械特性。由于细胞可以在双网络动态交联的超分子水凝胶中自由迁移，这种支架能够空间调节MSCs的初始细胞组织结构，形成球形的MSC微球和分散的纺锤形MSCs，这有利于同时进行成软骨/成骨分化和整合再生。然而，仅使用这种支架无法确保MSCs成功分化为靶细胞，特别是球形MSC微球向透明软骨细胞簇的分化。因此，需要在支架中加载诱导因子如TGF-β1和OP，以确保高效的分化和最终实现缺损软骨下骨组织的整合再生。

在体外实验中，我们观察到，当TGF-β1被加载在软骨区域时，MSCs在水凝胶块中保持球形，并且没有观察到F-actin丝的延伸。这些细胞表达了高水平的成软骨标志物，如SOX9、COL II和ACAN，而表达水平较低的成骨标志物如RUNX2和OCN。相反，当没有加载TGF-β1时，一些MSCs从水凝胶块中迁移到软骨框架中，表现出扩展的细胞形态和显著的F-actin丝延伸。此外，这些细胞表现出较低水平的SOX9、COL II和ACAN表达，并有轻微的RUNX2和OCN表达上调。在软骨下骨区域，当OP被加载时，观察到显著的成骨分化，表现出较高的细胞密度。而没有OP加载的软骨下骨区域则表现出较低的成骨分化。

在体内实验中，我们使用MRI和μ-CT分析了不同组的组织再生情况。结果表明，加载了TGF-β1和OP的软骨下骨支架能够再生出光滑的组织表面，与周围宿主软骨组织相似，而没有加载这些因子的支架则表现出相对粗糙的表面和凹凸结构。在负对照组中，仍可以在缺损中心观察到空腔，而周围部分则表现出轻微的组织再生。3个月后，所有兔子被处死，取出标本并用4% PFA固定，进行MRI和μ-CT分析。结果显示，加载了TGF-β1和OP的软骨下骨支架在缺损部位表现出显著的组织再生，包括明显的软骨区、界面层和软骨下骨区。再生的透明软骨厚度超过600微米，远高于仅使用软骨下骨支架的组。此外，再生的软骨下骨表现出较高的成熟度，显示出较粗的骨小梁结构（直径范围：133-250微米）。

尽管本研究取得了显著成果，但仍存在一些局限性。首先，所使用的基于蛋白质的超分子水凝胶基质具有较高的细胞亲和力，容易被MSCs分泌的基质金属蛋白酶（MMPs）降解，最终导致细胞纤维化。因此，需要开发对MMPs不敏感的超分子水凝胶，以替代当前的蛋白质基水凝胶。其次，尽管提出了维持细胞聚集结构和提高成软骨分化效率的假设，但需要进一步的实验来验证这些假设。第三，需要更好的策略来控制和均匀化细胞聚集的大小，以更准确地模拟天然软骨层中透明软骨细胞的空间分布。

结论部分指出，本研究成功制备了具有异质结构和调节MSCs细胞组织结构能力的双相软骨下骨支架。当MSCs被种植在支架的不同区域时，表现出不同的细胞形态分化路径。在软骨下骨区域，MSCs呈现出扩展的形态，而在软骨区域，MSCs自发形成聚集。然而，如果没有TGF-β1的递送，软骨区域的MSC聚集会在7天内失去其聚集体结构，形成纤维软骨样细胞。当TGF-β1被递送时，MSC聚集能够高效分化为透明软骨细胞，表现出显著的成软骨标志物表达。OP在软骨下骨区域的递送也显著提高了MSC的成骨分化。体内动物实验结果表明，加载了TGF-β1和OP的软骨下骨支架能够成功再生缺损软骨下骨组织，其中TGF-β1和超分子水凝胶在再生成熟透明软骨方面表现出协同效应。相比之下，没有加载生长因子的支架会导致透明软骨再生失败，而软骨下骨只能部分再生。这种定制化的软骨下骨支架由于其能够复制天然组织的异质性，展现出巨大的转化潜力。其模块化设计可以灵活适应不同的生物活性信号或细胞类型，从而实现对不同类型软骨下骨缺损的个性化治疗。未来的工作可以集中在将当前的智能水凝胶替换为经过FDA批准的具有相似细胞响应性的水凝胶，并对加载了与TGF-β1/OP功能相似的生物分子/药物的软骨下骨支架进行功能评估和体内验证，以实现整合的软骨下骨再生并促进临床转化。