《Microbial Pathogenesis》：Nucleoside Diphosphate Kinase (
LdNDK2): A metacyclogenesis-regulating kinase essential for
Leishmania parasite survival within eukaryotic host cells
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利什曼iasisNDK2的功能与结构研究揭示其在寄生虫代谢调控和宿主免疫逃逸中的关键作用，基因敲除导致形态异常和生长缺陷，并证实其通过磷酸转移维持细胞能量平衡。
安基特·古普塔（Ankit Gupta）| 米尔扎·阿迪尔·贝格（Mirza Adil Beg）| 苏尔比·巴德瓦尔（Surbhi Badhwar）| 斯瓦蒂·斯里瓦斯塔瓦（Swati Srivastava）| 拉胡尔·斯里瓦斯塔瓦（Rahul Srivastava）| 尼蒂·普里（Niti Puri）| 阿贾伊·萨克塞纳（Ajay Saxena）| 马利克·Z·阿卜丁（Malik Z. Abdin）| 安加穆图·塞尔瓦潘迪安（Angamuthu Selvapandiyan）
印度新德里贾米亚·哈姆达德（Jamia Hamdard）分子医学系，邮编110062
摘要
核苷二磷酸激酶（NDK）通过“乒乓球”机制将磷酸从核苷三磷酸（NTP）转移到核苷二磷酸（NDP）上，这一过程对原核生物和真核生物都有益处。在利什曼原虫（Leishmania donovani）中，我们鉴定出一种潜在的NDK2（LdNDK2），推测其在核苷酸代谢和细胞能量调节中起关键作用。为了研究其功能和酶学特性，我们克隆、表达了重组的LdNDK2并通过ADP-Glo测定法确认了其酶活性。利用圆二色光谱分析了其二级结构和热稳定性，而色氨酸荧光测定显示ATP的γ-磷酸首先被转移到rLdNDK2上，形成磷酸酶中间体。进一步通过测量乳酸脱氢酶的释放量来评估rLdNDK2在LPS激活的THP-1细胞中通过ATP介导的细胞裂解中的作用。
利用CRISPR-Cas9技术，我们对LdNDK2进行了荧光标记，将其定位到内膜系统的不同区域。体外研究表明，经过CRISPR-Cas9处理的LdNDK2缺失型（LdNDK2-/-）前鞭毛体表现出更长的鞭毛、缩小的细胞体、改变的细胞分裂周期以及比野生型寄生虫更快的生长速度。LdNDK2-/-型寄生虫停留在后期生活阶段，而野生型寄生虫则持续分化。通过重新表达LdNDK2验证了这些形态变化和生长缺陷。
LdNDK2-/-型寄生虫的感染显著降低了肥大细胞和THP-1巨噬细胞的存活率和恢复能力，流式细胞术显示宿主细胞中的凋亡增加，这可能是由于寄生虫无法利用NDK酶来防止细胞裂解。我们的发现突显了LdNDK2在后期生活阶段形成和免疫逃逸中的关键作用，表明其具有治疗利什曼病的潜力。
引言
核苷二磷酸激酶（NDK）是存在于真核生物和原核生物中的保守酶，负责维持细胞内核苷三磷酸（NTP）的水平[1]。它们通过“乒乓球”机制发挥作用，将γ-磷酸从NTP供体转移到核苷二磷酸（NDP）受体上，磷酸化发生在活性位点的组氨酸残基上，形成磷酸酶中间体[2]。锥虫无法从头合成嘌呤，而是依赖从宿主体内提取嘌呤并将其转化为核苷和核苷酸的途径。NDK催化嘌呤和嘧啶生物合成的最后一步，将NDP转化为NTP，使其成为核苷酸代谢中的关键酶，因此成为治疗干预的潜在靶点[3]、[4]。
大多数关于NDK的研究集中在LdNDK1上，而其他NDK（LdNDK2和LdNDK3）仍需进一步探索[5]、[6]。先前的研究表明，利什曼原虫会分泌LdNDK1以防止感染后ATP介导的细胞裂解[1]。NDK参与多种生理过程，如能量代谢、多糖合成、DNA修复以及细菌的双组分系统。NDK还参与信号转导系统，维持细胞内的NTP池对细胞健康至关重要[7]。其生物学效应可能由于NTP水平失衡或其激酶活性异常而产生。利什曼原虫的后期生活阶段形成过程中NDK的作用尚未得到研究，我们研究了利什曼原虫的LdNDK2基因（LdNDK2+/+），试图揭示促进寄生虫向后期生活阶段分化的因素[8]、[9]。本文建立了LdNDK2蛋白的酶活性，展示了其在细胞内的定位，以及由于LdNDK2基因敲除（LdNDK2-/-）导致的形态变化和生长缺陷，强调了LdNDK2蛋白在寄生虫宿主体内存活中的重要性，并对其结构进行了详细研究。
实验部分
利什曼原虫培养条件
所有实验均使用利什曼原虫（Leishmania donovani，菌株1S，WHO编号：MHOM/SD/62/1S，LdNDK2+/+）的前鞭毛体和无菌无鞭毛体形式进行。LdNDK2+/+的前鞭毛体在26°C下使用M199培养基（pH 6.8）培养。无菌无鞭毛体的培养方法如下：将处于对数中期前鞭毛体加入无菌无鞭毛体培养基（pH 5.6），并在37°C、5% CO2和20% FBS条件下培养[10]、[11]。
LdNDK2蛋白的表达与纯化
为了纯化全长LdNDK2蛋白，使用了...
LdNDK2蛋白的结构预测
LdNDK2蛋白的结构与两个已知结构（3 NGT和4 KPC）进行了比对。比对结果显示激酶结构域中的活性位点具有高度保守性。KPN环是LdNDK2酶活性的关键，三种结构中的脯氨酸残基均保持不变（图1A）。全长LdNDK2蛋白（337个残基，分子量约37kDa）包含一个N端结构域（1-196个残基）和一个激酶结构域（196-337个残基）（图1）
讨论
利什曼原虫拥有三个NDK基因拷贝。其中LdNDK1（17 kDa）编码最小的蛋白，仅包含NDPk1结构域。另外两个NDK基因LdNDK2（37 kDa）和LdNDK3（38 kDa）编码较大的蛋白，分别含有未知功能的结构域（DUF）和NDPk7B结构域[41]。大多数研究集中在LdNDK1上，而LdNDK2和LdNDK3尚未得到充分研究[5]。在本研究中，我们从分子和生化角度表征了一种潜在的NDK...
结论
我们的研究表明LdNDK2蛋白在调控利什曼原虫生物学关键方面起着重要作用，特别是在后期生活阶段的形成和宿主体内的生存适应中，表明其在维持核苷酸稳态和免疫逃逸机制中的关键功能。这些发现强调了LdNDK2蛋白作为干扰利什曼原虫生命周期的潜在治疗靶点的重要性。
统计分析
使用Graph Pad Prism 5.0（美国圣地亚哥）进行ANOVA和学生t检验以计算差异的显著性。*p < 0.05表示样本间存在显著差异。
CRediT作者贡献声明
阿贾伊·萨克塞纳（Ajay Saxena）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、项目监督、软件使用、资源提供、项目管理、方法设计、资金筹集、概念构思。尼蒂·普里（Niti Puri）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、项目监督、软件使用、资源提供、项目管理。拉胡尔·斯里瓦斯塔瓦（Rahul Srivastava）：数据分析。安加穆图·塞尔瓦潘迪安（Angamuthu Selvapandiyan）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、结果验证、项目监督、软件使用、资源提供、项目管理、方法设计、实验设计、资金筹集
数据可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及其支持信息文件中。如需额外数据或原始数据，可向相应作者索取。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了ICMR DHR（授权号GIA/2/VBD/2021/ECD-II）、DBT（授权号BT/PR51192/MED/29/1662/2023）、DBT BUILDER（授权号BT/INF/22/SP45382/2022）和DST FIST-II（授权号SSR/FST/LSII-046/2016(C)）的研究资助。SB获得了印度生物技术部的资深研究奖学金，AG获得了CSIR-UGC SRF奖学金（编号325245）的支持。
