利用逆转录数字PCR和高性能液相色谱-同位素稀释质谱法开发日本脑炎病毒认证参考物质

《Microchemical Journal》：Development of certified reference material of Japanese encephalitis virus by reverse transcription digital PCR and high-performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry

日本脑炎病毒（JEV）RNA定量检测参考材料（CRM）开发及验证，通过逆转录数字PCR（RT-dPCR）和高性能液相色谱-同位素稀释质谱（HPLC-IDMS）建立正交方法，优化RT效率校正（80.94%），验证CRM在-70℃及干冰条件下的均一性与稳定性，认证值为(7.4±1.3)×10^4 copies/μL。

　　

牛春燕|董连华|王世伟|杨金|高云华

中国国家计量研究院先进测量科学中心，北京 100029

摘要

日本脑炎病毒（JEV）是一种重要的动物源性病原体，可引发日本脑炎，在亚洲和西太平洋地区对公共卫生造成广泛影响。准确量化JEV RNA对于诊断验证和流行病学监测至关重要，因此需要使用经过认证的参考物质（CRM）来确保测量结果的可比性。本研究利用逆转录数字PCR（RT-dPCR）和高性能液相色谱-同位素稀释质谱法（HPLC-IDMS）开发了一种针对prM和E基因的JEV CRM。所建立的RT-dPCR方法在10至10^4拷贝/μL的范围内表现出优异的线性（R^2 = 1.0000）和重复性（RSD < 5%）。HPLC-IDMS作为一种高精度且不受RT步骤影响的参考方法，能够提供可追溯的绝对RNA浓度测量结果。这有助于精确确定逆转录效率为80.94%，并据此校正RT-dPCR的结果。该CRM在长期（-70°C）和短期（干冰）条件下均表现出良好的均一性和稳定性。其认证值为（7.4 ± 1.3）× 10^4拷贝/μL（k = 2）。该CRM为JEV检测提供了可追溯的标准，提高了分子诊断和监测工作的可靠性。

引言

日本脑炎病毒（JEV）是导致日本脑炎的主要原因，这种新兴的动物源性疾病影响了世界卫生组织东南亚和西太平洋地区的24个国家，超过30亿人面临感染风险[1,2]。JEV主要通过库蚊（Culex）传播，水鸟和猪是其扩增宿主[2,3]。人类感染JEV的症状从无症状到重症不等，重症病例中急性脑炎的致死率可达30–50%，且幸存者常会出现长期后遗症[4]。气候变化和农业扩张导致其地理分布范围不断扩大，因此亟需改进监测和疫苗接种策略[1,5]。

作为黄病毒科（Flaviviridae）的一员，JEV具有约11 kb的单链RNA基因组[6]。该基因组编码三种结构蛋白（衣壳蛋白C、前膜蛋白prM和包膜蛋白E），这些蛋白构成病毒颗粒的结构；同时编码七种非结构蛋白（NS1-NS5），它们对病毒复制和免疫逃逸至关重要[7,8]。E蛋白有助于病毒进入宿主细胞，是中和抗体的主要靶标[9]。从系统发育学上看，JEV分为五种基因型（GI-GV），其中GI和GIII型最常与人类疫情相关[10]。

逆转录定量PCR（RT-qPCR）方法可用于JEV的诊断和监测，目前已有多种相关检测方法[[11], [12], [13], [14], [15], [16]]。经过认证的参考物质（CRM）在病原体检测中发挥着重要作用，它们确保了不同检测方法和产品之间的结果可比性[[17], [18], [19], [20], [21]]。由于其特性明确且数值准确，CRM可作为通用基准，帮助研究人员和临床人员校准测量系统、验证检测性能并协调结果。

对于RNA的定量，逆转录数字聚合酶链反应（RT-dPCR）是最常用的方法，因为它具有可追溯性且无需外部校准物[17,18,20]。然而，逆转录（RT）步骤对定量结果的影响仍需进一步研究。引物和探针的差异[20]以及转录步骤参数的变化[22]都可能导致定量结果出现偏差。因此，采用独立于RT步骤的方法进行适当优化和验证至关重要。还有其他几种用于核酸分子定量的方法，如电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）[23]、高性能液相色谱-同位素稀释质谱（HPLC-IDMS）[24]和单分子计数[25]。在本研究中，我们建立了RT-dPCR和HPLC-IDMS方法来检测JEV，并开发了针对JEV prM和E基因的RNA参考物质。

候选CRM的制备与鉴定

目标基因包含JEV的prM和E基因，其GenBank登录号为KM658163.1（核苷酸位置481–2459），由Sangon Biotech(China)公司合成并插入pBlueScript II SK(+)质粒中。使用MEGAscript? T7转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific, USA）进行体外转录。质粒DNA通过Not I（Takara, Japan）完全线性化后作为模板。转录反应使用20 μL的混合液进行

候选CRM的鉴定

本研究中使用的JEV CRM为体外转录的RNA形式。模板DNA的序列通过Sangon Biotech(China)公司的Sanger测序得到确认。转录RNA的纯度和完整性通过Agilent 2100 Bioanalyzer和NanoDrop 2000仪器进行检测。电泳图谱中显示出一个位于预期分子量的单一清晰条带（见图S1）。A260/A280比为2.1，A260/A230比为2.2，表明RNA的纯度和完整性良好

结论

本研究成功建立了一种用于准确量化JEV RNA的CRM，目标基因为prM和E基因。RT-dPCR与HPLC-IDMS的结合使用是一种稳健的正交策略，有效克服了依赖RT方法的局限性，特别是逆转录效率带来的偏差。优化的RT-dPCR方法具有高精度、线性和重复性，适用于RNA定量。HPLC-IDMS则提供了一种不受RT步骤影响的定量方法

作者贡献声明

牛春燕：撰写初稿、方法设计、实验设计、资金申请、数据分析、概念构思。董连华：实验监督、方法设计、概念构思。王世伟：数据分析、数据管理。杨金：数据分析。高云华：概念构思。

资助

本文所述工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFF0724501）的资助。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。